免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)基本原理

1免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理體外抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素體內(nèi)：抗原+抗體→免疫反應(yīng)體外：抗原+抗體→進(jìn)行檢測(cè)檢測(cè)抗原或抗體的體外實(shí)驗(yàn)(血清學(xué)實(shí)驗(yàn)）凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)免疫細(xì)胞功能的檢測(cè)第一頁，共38頁。2第一節(jié)

體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素（一）抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)

1.

高度特異性2.

表面化學(xué)基團(tuán)之間的可逆結(jié)合（可逆性）3.

適宜的抗原抗體濃度和比例（比例性）4.抗原抗體反應(yīng)的兩個(gè)階段①抗原抗體特異性結(jié)合階段②可見反應(yīng)階段

第二頁，共38頁。31.高度特異性抗原抗體反應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位(決定簇)與抗體CDR的互補(bǔ)結(jié)合(相互吻合，具有互補(bǔ)性)。第三頁，共38頁。4抗原和抗體的結(jié)合是互補(bǔ)性的特異性結(jié)合。通過非共價(jià)鍵結(jié)合。2.表面化學(xué)基團(tuán)之間的可逆結(jié)合（可逆性）第四頁，共38頁。5AbAgAbAg特異性結(jié)合力的表示方法親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab結(jié)合的力親和力親合力低親和力高親和力第五頁，共38頁。63.適宜的抗原抗體濃度和比例（比例性）第六頁，共38頁。7（二）抗原抗體反應(yīng)的影響因素1.電解質(zhì)

0.85%氯化鈉或各種緩沖液2.溫度

37℃56℃3.酸堿度

最適pH值在6-8之間第七頁，共38頁。8第二節(jié)檢測(cè)抗原或抗體的體外試驗(yàn)第八頁，共38頁。9定義：顆粒性抗原(細(xì)菌、細(xì)胞等或表面包被抗原的顆粒)與相應(yīng)的抗體在電解質(zhì)存在的條件下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)塊現(xiàn)象。一、凝集反應(yīng)（agglutinationreactions)第九頁，共38頁。10包括：1.直接凝集反應(yīng)(directagglunitationreatctions)

玻片法：ABO血型鑒定、細(xì)菌鑒定試管法：抗體效價(jià)的判定2.間接凝集反應(yīng)

(indirectagglunitationreactions)第十頁，共38頁。11直接凝集反應(yīng)1:2稀釋待測(cè)血清1:41:81:16玻片法試管法ABO血型鑒定或菌種鑒定檢測(cè)抗體的滴度或效價(jià)第十一頁，共38頁。12將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫做間接凝集反應(yīng)。間接凝集反應(yīng)第十二頁，共38頁。13二、沉淀反應(yīng)（precipitationreactions）定義：可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)電解質(zhì)存在條件下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。第十三頁，共38頁。14可在液體/半固體瓊脂中進(jìn)行。包括：1.單向瓊脂擴(kuò)散（可溶性抗原定量）2.雙向瓊脂擴(kuò)散3.免疫電泳第十四頁，共38頁。15AgAgAgAgAbingel單向瓊脂擴(kuò)散用于確定抗原濃度第十五頁，共38頁。16Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴(kuò)散鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同，抗原純度鑒定第十六頁，共38頁。17免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。第十七頁，共38頁。18

將抗原抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，將已知的抗體或抗原標(biāo)記上失蹤物質(zhì)，通過檢測(cè)標(biāo)記物，間接測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物的一類試驗(yàn)方法。

三、免疫標(biāo)記技術(shù)(immunolabelingtechniques)第十八頁，共38頁。19常用的標(biāo)記物：

酶

熒光素

放射性元素

膠體金

化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等第十九頁，共38頁。20①免疫酶測(cè)定法雙抗體夾心法ELISA間接ELISAa）b）BAS—ELISA

利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁第二十頁，共38頁。21d）免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測(cè)第二十一頁，共38頁。22②免疫熒光技術(shù)第二十二頁，共38頁。23第二十三頁，共38頁。24③放射免疫測(cè)定

用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫測(cè)定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測(cè)。常用的有131I、125I。④化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。靈敏度高、簡便、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。第二十四頁，共38頁。25⑤免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標(biāo)記Ab/Ag，以檢測(cè)未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。第二十五頁，共38頁。26⑥免疫印跡法-Westernblotting第二十六頁，共38頁。27四、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微陣列，指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)。第二十七頁，共38頁。28第三節(jié)免疫細(xì)胞功能的檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離免疫細(xì)胞功能測(cè)定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽-MHC四聚體技術(shù)T細(xì)胞功能測(cè)定B細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞因子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功能測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法第二十八頁，共38頁。29一、免疫細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離稀釋血液淋巴細(xì)胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺)離心第二十九頁，共38頁。30E花環(huán)形成試驗(yàn)第三十頁，共38頁。31磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離第三十一頁，共38頁。32免疫吸附分離法加入淋巴細(xì)胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清第三十二頁，共38頁。33磁珠分離法第三十三頁，共38頁。34流式細(xì)胞術(shù)熒光抗體標(biāo)記混合細(xì)胞噴嘴單細(xì)胞懸液5000-10000個(gè)/秒細(xì)胞分選器熒光檢測(cè)器第三十四頁，共38頁。35二、免疫細(xì)胞功能的測(cè)定T細(xì)胞功能測(cè)定B細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞因子檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功能測(cè)定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法第三十五頁，共38頁。36T細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測(cè)T細(xì)胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以下三種方法檢測(cè)：形態(tài)計(jì)數(shù)法：活化細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細(xì)胞核松散及出現(xiàn)較多核仁；3H-TdR或125I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液體閃爍儀檢測(cè)樣品的放射活性，特點(diǎn)是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法：外來抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，再用相同的抗原作皮試，可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T細(xì)胞活化并釋放多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單個(gè)核細(xì)胞浸潤為主的炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h到達(dá)高峰。陽性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強(qiáng)烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細(xì)胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應(yīng)。常用于檢測(cè)某些微生物感染、免疫缺陷病、腫瘤患者免疫功能測(cè)定。第三十六頁，共38頁。37B細(xì)胞功能測(cè)定抗體含量測(cè)定溶血空斑試驗(yàn)可通過單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散法、ELISA、速率比濁法等測(cè)定標(biāo)本中各類Ig的含量。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫動(dòng)物4天后取出動(dòng)物脾臟，在脾細(xì)胞懸液中含有抗SRBC的漿細(xì)胞脾