慢性疼痛基因治療研究現(xiàn)狀和展望

今日主題慢性疼痛的概念與機(jī)制尋找慢性疼痛治療新方法的迫切性慢性疼痛的基因治療的研究基因治療希望與困難并存第一頁，共80頁。慢性疼痛的概念與機(jī)制第二頁，共80頁。定義

慢性疼痛

指在引起急性疼痛的因素消退以后仍然持續(xù)存在的疼痛，或伴隨慢性原始病程產(chǎn)生的疼痛，諸如創(chuàng)傷或損傷、偏頭痛、各類關(guān)節(jié)炎、血管神經(jīng)疾病和癌癥的伴隨癥狀。第三頁，共80頁。疼痛反應(yīng)對于生物體和生存是一把雙刃劍，在應(yīng)激過程中使生物體能夠趨利避害，做出保護(hù)自身的反應(yīng)，而當(dāng)疼痛的程度過強(qiáng)或者其持續(xù)時間較長，機(jī)體內(nèi)則將產(chǎn)生一系列反應(yīng)使機(jī)體的內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，而不利于正常生存。第四頁，共80頁。疼痛治療的現(xiàn)代觀念疼痛是一種疾病疼痛永遠(yuǎn)是惡性的，需要治療疼痛是傷害性或潛在組織損傷引起的不愉快感覺，常伴有內(nèi)分泌、代謝、免疫和精神心理改變第五頁，共80頁。

慢性疼痛它不僅給病患者帶來了難以忍受的痛苦，同時也給社會的發(fā)展和家庭的和諧增添了無形的阻力。已成為危害公共健康一大問題。慢性疼痛

——危害性與普遍性第六頁，共80頁。慢性疼痛的分類神經(jīng)性痛傳遞疼痛信號過于強(qiáng)烈，機(jī)體產(chǎn)生不適應(yīng)炎性痛機(jī)體內(nèi)的某些物質(zhì)（炎性因子或炎性介質(zhì)）過多，不斷地刺激產(chǎn)生痛覺的感受器，使人體感受到痛癌痛既有神經(jīng)性痛也有炎性痛的的特殊類型第七頁，共80頁。疼痛傳遞的感受

致痛因子如熱、冷、機(jī)械壓力、化學(xué)物質(zhì)等作用于疼痛感受器（分布于全身的特殊的感覺神經(jīng)末梢）。第八頁，共80頁。

不同直徑的初級傳入神經(jīng)元傷害刺激和其感受器特異性激活后產(chǎn)生的疼痛信號經(jīng)過不同的初級傳入神經(jīng)傳到不同區(qū)域的脊髓背角。初級傳入神經(jīng)元有不同的直徑，根據(jù)直徑的大小可分為三大類，分別傳遞不同的信息。初級傳入神經(jīng)元本體覺輕觸覺定位明確的傷害性刺激定位模糊的傷害性刺激第九頁，共80頁。疼痛上傳通路脊髓背角背根神經(jīng)節(jié)脊髓丘腦束大腦皮層產(chǎn)生感知定位第十頁，共80頁。內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)：1、下行抑制旁路：5－HT;去甲腎上腺素纖維對傳導(dǎo)疼痛的上行旁路有一定抑制作用。2、內(nèi)源性嗎啡肽：內(nèi)啡肽和腦啡肽等與上行旁路突觸周圍的阿片受體結(jié)合，阻斷興奮性遞質(zhì)的釋放，降低痛覺。第十一頁，共80頁。

疼痛的敏化機(jī)制中樞敏化外周敏化外周敏化中樞敏化第十二頁，共80頁。癌癥（WHO統(tǒng)計）全球年新發(fā)癌癥患者1000萬，40%伴有不同程度的疼痛；60%～90%的晚期癌癥患者有不同程度的疼痛，70%以疼痛為主要癥狀全世界至少有500萬人忍受著癌癥疼痛的折磨我國每年癌癥新發(fā)病人數(shù)約有180萬，其中62％伴有疼痛癌痛的危害性疼痛不僅是一個醫(yī)學(xué)問題，逐漸變成了一個社會性問題第十三頁，共80頁?，F(xiàn)有疼痛治療的局限性藥物治療非甾體抗炎藥（NSAID）潛在的心血管風(fēng)險阿片類藥物耐受與戒斷現(xiàn)有藥物性、神經(jīng)阻滯、物理、心理、中醫(yī)、手術(shù)治療等治療方法第十四頁，共80頁。神經(jīng)阻滯指在末梢的腦、脊神經(jīng)（或神經(jīng)節(jié)）、交感神經(jīng)節(jié)等神經(jīng)內(nèi)或神經(jīng)旁注入藥物或以手術(shù)物理方法阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)功能需要在短期內(nèi)重復(fù)治療及影響神經(jīng)的功能第十五頁，共80頁。脊髓刺激通過放置硬膜外電極，提供電刺激作用于脊髓后根稱脊髓刺激（SpinalCordStimulation，SCS）物理、心理、中醫(yī)等治療解除疼痛的機(jī)理尚不十分清楚，療效不確切第十六頁，共80頁。雖然使用這些藥物和方法確實(shí)能產(chǎn)生好的鎮(zhèn)痛效果，但伴隨而來的是一些令人憂慮的副作用藥物治療給人們和社會帶來的后期效果是復(fù)雜的，人們越來越意識到化學(xué)藥物治療的缺陷，尋找一種先進(jìn)并且治療效果好的方法是慢性疼痛治療中非常迫切的課題。第十七頁，共80頁。

傳統(tǒng)藥物治療基因治療優(yōu)點(diǎn)使用方便效果明確可多次反復(fù)使用，但易發(fā)生不良反應(yīng)一次應(yīng)用可長時間鎮(zhèn)痛，作用效果可維持?jǐn)?shù)十天，甚至數(shù)月缺點(diǎn)應(yīng)用劑量大或多次使用后將產(chǎn)生戒斷癥狀、耐受、藥物依賴（成癮）等副作用。少見，多是輕微的感冒樣癥狀兩種治療方法的比較第十八頁，共80頁。慢性疼痛的基因治療的研究第十九頁，共80頁。什么是基因治療？

基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。

DNA

？

疾病

第二十頁，共80頁?；蛑委煹臉?biāo)靶與范圍基因治療的靶細(xì)胞主要分為兩大類：體細(xì)胞和生殖細(xì)胞。目前開展的基因治療只限于體細(xì)胞?；蛑委熌壳爸饕侵委熌切θ祟惤】低{嚴(yán)重的疾病。包括：遺傳?。ㄈ缪巡　⒛倚岳w維病、家庭性高膽固醇血癥等）、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾?。ㄈ鏏IDS、類風(fēng)濕等）。

第二十一頁，共80頁?；蛑委煹钠鹗?989年美國Rosenberg等經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)，進(jìn)行了標(biāo)志基因轉(zhuǎn)移到人體的首次臨床試驗(yàn)。1990年11月美國NIH的Blease，Culver和Anderson進(jìn)行了首例人體基因治療的臨床試驗(yàn)，并取得了巨大的成功。第二十二頁，共80頁?；蛑委煹难芯楷F(xiàn)狀

基因治療在經(jīng)歷了準(zhǔn)備期、狂熱期后，從1996年進(jìn)入了理性期。美國成立了三個研究基因?qū)胂到y(tǒng)與載體的研究機(jī)構(gòu)；從1996年至今，全世界的基因治療臨床方案增加了數(shù)倍，參加治療的病人數(shù)也有相應(yīng)增加。從投資來看，除國家投資外，企業(yè)界的熱情有增無減，目前每年的總投資在20億美元左右。這些都說明基因治療研究已經(jīng)以穩(wěn)健的步伐跨入了二十一世紀(jì)！第二十三頁，共80頁。到2005年1月止基因治療迄今共有1020個方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)。其中方案主要集中在美洲和歐洲，各有682和288個。美國最多，有669個方案。我國數(shù)量較少，僅有3個方案。針對癌癥的治療仍是基因治療的首選目標(biāo)，但其所占比重相對于1996年的統(tǒng)計已經(jīng)有所下降。第二十四頁，共80頁?；蛑委熍R床方案

第二十五頁，共80頁。采用的基因?qū)胂到y(tǒng)目前在基因治療中所采用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)主要有反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、裸DNA、脂質(zhì)體和腺相關(guān)病毒載體等，其中腺病毒載體和反轉(zhuǎn)錄病毒載體占絕大部分，分別有260和261個方案采用，而腺相關(guān)病毒載體只有27個，可能是由于腺相關(guān)病毒的生產(chǎn)仍有待突破。第二十六頁，共80頁。治療基因

選擇主要集中于抗體、腫瘤抑制劑和細(xì)胞因子三個方面。

第二十七頁，共80頁。

基因治療要取得實(shí)質(zhì)性的突破，必須解決三個關(guān)鍵問題，即基因?qū)胂到y(tǒng)、基因表達(dá)的可控性及治療效果明確的治療基因?；蛑委熁?qū)胂到y(tǒng)基因表達(dá)的可控性治療效果明確的基因第二十八頁，共80頁。慢性疼痛基因治療可行嗎？答案是肯定的！單次治療持續(xù)時間顯著延長內(nèi)源性基因產(chǎn)物不易耐受成癮產(chǎn)物對正常神經(jīng)系統(tǒng)功能影響小第二十九頁，共80頁。

疼痛基因治療的策略

上調(diào)抗痛基因表達(dá)

利用基因重組技術(shù)將一些抗痛基因、調(diào)控因子基因及受體基因等外源基因插入載體基因組，加上啟動子，導(dǎo)入神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)抗痛基因的表達(dá)。下調(diào)疼痛基因表達(dá)

降低神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性疼痛分子的表達(dá)，目前基因治療中常用的knockdown技術(shù)有反義寡核苷酸技術(shù)(antisenseoligonucleotide,as0DN)和RNA干擾(RNAi)。第三十頁，共80頁。上調(diào)抗痛基因表達(dá)第三十一頁，共80頁。常用目的基因主要是阿片肽基因－＋－已克隆ORL孤啡肽？＋＋＋＋未克隆μ內(nèi)嗎啡肽－＋－已克隆κ強(qiáng)啡肽＋＋＋＋已克隆μδεβ-內(nèi)啡肽＋＋＋＋已克隆δ腦啡肽基因治療鎮(zhèn)痛作用基因受體阿片肽第三十二頁，共80頁。神經(jīng)營養(yǎng)因子家族：是一類能夠促進(jìn)特定神經(jīng)組織細(xì)胞分化、再生，刺激神經(jīng)遞質(zhì)釋放并且能改變神經(jīng)元特性的蛋白分子，包括NT3、NT4、BDNF、NGF等。主要是通過抑制神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)阿片肽釋放治療疼痛，適用于神經(jīng)損傷或中毒導(dǎo)致的慢性神經(jīng)痛。免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子：IL-2和IL-10。其中前者主要通過類阿片肽作用，后者通過抑制神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)達(dá)到鎮(zhèn)痛目的。其他目的基因主要是細(xì)胞因子第三十三頁，共80頁。腦啡肽基因治療實(shí)驗(yàn)報導(dǎo)1999年，EatonMJ

等將前腦啡肽原基因構(gòu)建到第一代人單純皰疹病毒基因組中，通過小鼠足底皮膚注射感染脊髓后角神經(jīng)元，高效表達(dá)的腦啡肽明顯抑制小鼠的冷熱刺激痛閾，治療持續(xù)時間達(dá)3個月。2001年，BrazJ等報導(dǎo)用前腦啡肽原基因治療關(guān)節(jié)炎性痛模型。2003年，GossJR

等報導(dǎo)重復(fù)注射這種基因治療系統(tǒng)治療慢性神經(jīng)痛模型，并無明顯的耐受發(fā)生。第三十四頁，共80頁。β-內(nèi)啡肽基因治療實(shí)驗(yàn)報導(dǎo)1995年BeutleAS.等將小鼠神經(jīng)生長因子前導(dǎo)肽與β－內(nèi)啡肽編碼基因的融合，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，培養(yǎng)基中可檢測到高濃度的β內(nèi)啡肽1999年AlanA.Finegold等采用這種融合基因重組的非增殖型腺病毒，大鼠腦脊液內(nèi)注射后，三天后腦脊液中的β內(nèi)啡肽的濃度達(dá)到正常大鼠和人腦脊液中β內(nèi)啡肽濃度的10-20倍，能夠有效地抑制炎性痛覺過敏2003年，我們構(gòu)建攜帶這種融合基因的腺病毒，觀察到對大鼠坐骨神經(jīng)痛具有顯著的鎮(zhèn)痛效果第三十五頁，共80頁。轉(zhuǎn)基因蛋白定量檢測大鼠腦脊液β-內(nèi)啡肽含量變化趨勢第三十六頁，共80頁。β-內(nèi)啡肽基因治療CCI模型CCI大鼠轉(zhuǎn)基因治療熱痛閾變化趨勢圖第三十七頁，共80頁。常用的轉(zhuǎn)基因載體病毒載體：轉(zhuǎn)染效率高，轉(zhuǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定單純皰疹病毒：神經(jīng)毒性大腺相關(guān)病毒：制備困難，裝載容量小，起效慢逆轉(zhuǎn)錄病毒：不能感染非分裂細(xì)胞，致畸、成瘤腺病毒：安全、易制備，宿主范圍廣，可感染處于不同周期的細(xì)胞非病毒載體：轉(zhuǎn)染率低，表達(dá)不穩(wěn)定細(xì)胞載體、脂質(zhì)體、裸DNA、真核表達(dá)載體等第三十八頁，共80頁?；蜉d體系統(tǒng)病毒載體系統(tǒng)非病毒載體系統(tǒng)腺病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒載體腺相關(guān)病毒載體單純皰疹病毒載體慢病毒載體裸DNADNA-陽離子脂質(zhì)復(fù)合物DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)包裝細(xì)胞外包裝DNA-陽離子多聚物DNA/RNA嵌合物第三十九頁，共80頁。優(yōu)點(diǎn)：1、利用病毒天然的感染性進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高；2、復(fù)雜的裝配過程由細(xì)胞完成；3、不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點(diǎn)。病毒載體系統(tǒng)細(xì)胞毒性染色體毒性免疫毒性存在的問題1、安全性 2、靶向性 3、有效性轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)效率基因表達(dá)水平和持續(xù)時間表達(dá)的可調(diào)控性第四十頁，共80頁。腺病毒生物學(xué)特性：

雙鏈DNA病毒，優(yōu)點(diǎn)是能感染分裂和非分裂細(xì)胞，高滴度制備容易，對人體的毒害作用輕微。缺點(diǎn)是免疫源性強(qiáng)，目的基因表達(dá)時間短。第四十一頁，共80頁。腺病毒結(jié)構(gòu)第四十二頁，共80頁。腺病毒基因組示意圖第四十三頁，共80頁。腺病毒轉(zhuǎn)移載體優(yōu)點(diǎn)1)安全2)宿主范圍廣3)感染性強(qiáng)4)人類蛋白可獲得高水平表達(dá)5)穩(wěn)定性比較好6)易于制備與純化7)制備的病毒滴度高8)可通過多種方式到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)第四十四頁，共80頁。腺病毒載體的缺點(diǎn)及改造缺點(diǎn)：1)載體容量有限（約8kb)2)宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性

3)基因表達(dá)時間短暫改造方向：剔除病毒基因組，保留包裝所需基因組分，獲得的二三代腺病毒的免疫源性將顯著降低，能有效延長目的基因的時效。通過外殼蛋白改造，使病毒對特異組織的親和力不斷提高,有效保證轉(zhuǎn)基因的效率。利用整合病毒如AAV和逆轉(zhuǎn)錄病毒的相關(guān)元件與腺病毒基因組重組構(gòu)建的嵌合病毒，有效整合人體染色體，保證目的基因的長期表達(dá)

第四十五頁，共80頁。三代腺病毒載體第一代：缺失的腺病毒基因片段是E1和/或E3區(qū)，屬于一類復(fù)制缺陷、非輔助病毒依賴型載體第二代：在第一代的基礎(chǔ)上，用溫敏突變子控制E2A基因產(chǎn)物DBP的表達(dá)，進(jìn)一步缺失E2區(qū)和/或E4第三代：即GutlessVector,mini-Ad，僅含有病毒DNA兩端的反向末端重復(fù)序列，中間夾有transgene，但至今仍處于研制階段

TR

TR

Transgenecassette第四十六頁，共80頁。改造

腺病毒基因組第四十七頁，共80頁。第三代腺病毒生產(chǎn)系統(tǒng)Ref：PackerMetal.,JRefractSurg.2002Nov-Dec;18(6):692-6繼承了第一代腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)可裝載容量大大增加(36Kb)機(jī)體免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性降低表達(dá)時間延長優(yōu)點(diǎn)：第四十八頁，共80頁。腺相關(guān)病毒生物學(xué)特性：

微小病毒科，優(yōu)點(diǎn)是有效整合宿主細(xì)胞染色體，可同時表達(dá)多個目的基因，免疫反應(yīng)輕，轉(zhuǎn)基因表達(dá)時間長達(dá)6個月以上。缺點(diǎn)是插入?yún)^(qū)小，最大只能插入4-5Kb的片段，制備時需要輔助病毒，易含有野毒，而且高滴度制備困難。整合基因可能導(dǎo)致宿主基因突變從而引起癌變研究方向：

高滴度和高純度制備技術(shù)制備嵌合病毒長期基因治療安全性第四十九頁，共80頁。第五十頁，共80頁。腺相關(guān)病毒包裝過程示意圖hostcellHelpervirusPackagingplasmidrepcapVectorplasmidrAAV的生產(chǎn)原理第五十一頁，共80頁。單純皰疹病毒生物學(xué)特性：

雙鏈DNA病毒，最大的優(yōu)點(diǎn)是嗜神經(jīng)性，外周皮膚或粘膜轉(zhuǎn)染該病毒后，感染神經(jīng)末梢，通過軸突運(yùn)輸機(jī)制進(jìn)入神經(jīng)元胞漿。缺點(diǎn)是神經(jīng)毒性大，病毒蛋白可以導(dǎo)致神經(jīng)元裂解。

研究方向：多IE（即刻－早期）基因剔除株（ICP4-：ICP22-：ICP27-）

的制備，這種復(fù)制缺陷病毒的毒性和免疫源性比單基因剔除株弱，而神經(jīng)親和力并不受影響。利用皰疹病毒的潛伏期啟動子作為基因表達(dá)啟動子，可以獲得長效表達(dá)第五十二頁，共80頁。其他病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒：

第一種應(yīng)用于臨床病人治療的病毒就是逆轉(zhuǎn)錄病毒，用于ADA缺乏導(dǎo)致的先天性免疫缺陷病人。逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個缺點(diǎn)是病毒不能感染非分裂細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞，此外它的整合是隨機(jī)，并不能作到定點(diǎn)整合，因此，有可能受到基因組的干擾而出現(xiàn)轉(zhuǎn)染沉默現(xiàn)象。艾滋病病毒：屬于慢病毒類，轉(zhuǎn)基因表達(dá)時間長。動物病毒：

某些動物病毒經(jīng)過改造后，人體對其不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而獲得長效基因表達(dá)第五十三頁，共80頁。非病毒載體簡介細(xì)胞載體：

最早的細(xì)胞移植載體選用的是人的或牛的腎上腺嗜鉻細(xì)胞，依靠嗜鉻細(xì)胞本身具有分泌兒茶酚胺類物質(zhì)。以后發(fā)展了采用不死細(xì)胞作為載體，通過基因克隆技術(shù)使這種細(xì)胞可以分泌阿片肽、GABA或兒茶酚胺。考慮到宿主抗外源細(xì)胞免疫反應(yīng)對細(xì)胞移植的影響，采用生物材料將細(xì)胞微囊化，將細(xì)胞的抗原隱蔽起來，降低了免疫反應(yīng)的程度。

脂質(zhì)體、基因槍、真核表達(dá)載體等：

共同的特點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)染效率低下：第五十四頁，共80頁。非病毒載體基因治療優(yōu)點(diǎn)低毒、低免疫反應(yīng)、外源基因整合幾率低、無基因插入片斷大小限制，以及使用簡單、制備方便、便于保存和檢驗(yàn)缺點(diǎn)導(dǎo)入效率低，且無靶向性第五十五頁，共80頁。概念

將一些特殊細(xì)胞植入到受者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過這些類似于“生物微泵”（bio-minipump）的細(xì)胞持續(xù)分泌鎮(zhèn)痛物質(zhì)而緩解疼痛或提高痛閾。

細(xì)胞載體第五十六頁，共80頁。細(xì)胞移植治療慢性疼痛－方法學(xué)主要手段將一些特殊的細(xì)胞（如嗜鉻細(xì)胞等）移植于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛調(diào)控靶位，移植的細(xì)胞如同一個“分泌泵”，可以持續(xù)地分泌具有鎮(zhèn)痛作用的活性物質(zhì)細(xì)胞來源來源于腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞和經(jīng)基因工程改造或修飾過的其它各類細(xì)胞第五十七頁，共80頁。細(xì)胞移植治療慢性疼痛－實(shí)踐把分離純化好的嗜鉻細(xì)胞注射到腰段蛛網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)有助于改善神經(jīng)痛模型的大鼠以及皮下注射福爾馬林的炎性痛模型的大鼠的痛行為國內(nèi)利用海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉微膠囊包裹純化的牛嗜鉻細(xì)胞進(jìn)行大鼠蛛網(wǎng)膜下腔移植，取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第五十八頁，共80頁。存在的問題

細(xì)胞來源較少、體外培養(yǎng)難以獲得較高的細(xì)胞濃度、細(xì)胞分泌鎮(zhèn)痛物質(zhì)的量及其存活時間和安全性較為有限解決方法

生物細(xì)胞永生化和去永生化技術(shù)建系細(xì)胞和基因工程修飾細(xì)胞的建立細(xì)胞移植治療慢性疼痛第五十九頁，共80頁。

是利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源性的永生化基因如猿病毒40大T抗原（SV40Tag）轉(zhuǎn)入到靶細(xì)胞或穩(wěn)定整合到靶細(xì)胞基因組中，獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從增殖危機(jī)中逃逸，從而獲得類似癌細(xì)胞的無限增殖能力，進(jìn)而建立永生化細(xì)胞株。生物細(xì)胞的永生化

第六十頁，共80頁。

在獲得具有分裂活性而又無復(fù)制衰老的原代永生化細(xì)胞后，通過Cre-loxP重組酶系統(tǒng)將兩翼“錨定”有l(wèi)oxP序列（LoxP-Flanked）位點(diǎn)的SV40Tag基因定向敲除，使細(xì)胞去永生化,從而消除致瘤性，此技術(shù)又稱為“可塑性永生化”。這一系統(tǒng)意味著可通過這一“基因開關(guān)”有目的地控制基因的表達(dá)。生物細(xì)胞的去永生化第六十一頁，共80頁。

采用基因工程修飾技術(shù)建立具有表達(dá)人腦啡膚的永生化和可誘導(dǎo)去永生化的神經(jīng)前體細(xì)胞系是細(xì)胞鎮(zhèn)痛中細(xì)胞來源的最理想的選擇。因其植入受者的蛛網(wǎng)膜下腔具有多分化潛能、較好的穩(wěn)定性、可控性、安全性以及組織相容性和長時間表達(dá)鎮(zhèn)痛蛋白的效果。建立可靠安全的鎮(zhèn)痛細(xì)胞庫第六十二頁，共80頁。下調(diào)疼痛基因表達(dá)

第六十三頁，共80頁。反義核苷酸定義：

是指能夠通過堿基互補(bǔ)與靶RNA（主要是mRNA）特異結(jié)合，抑制靶RNA的功能，從而控制其表達(dá)的一類小分子轉(zhuǎn)錄物。因此，它是通過下調(diào)某種基因產(chǎn)物來發(fā)揮作用。作用原理：在復(fù)制水平上，作為DNA復(fù)制的抑制因子，與引物RNA前體結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄水平上與mRNA5’－端結(jié)合阻斷轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。在翻譯水平上與mRNA編碼區(qū)（主要是起始密碼）或非翻譯區(qū)結(jié)合，直接或間接抑制翻譯。影響前mRNA的剪接或阻止mRNA的成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)。與mRNA結(jié)合，促進(jìn)mRNA的降解。第六十四頁，共80頁。反義核苷酸靶基因靶基因：

主要是參與痛覺傳導(dǎo)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)的受體或蛋白的編碼基因，這些基因的產(chǎn)物直接或間接導(dǎo)致慢性疼痛病人神經(jīng)元的高敏現(xiàn)象。種類：PKC-y蛋白NMDA受體外周鈉通道蛋白大麻醇受體乙酰膽堿M型和N型受體神經(jīng)激肽（NK）－1受體P物質(zhì)受體（SPR）第六十五頁，共80頁。反義核苷酸的優(yōu)點(diǎn)和不足優(yōu)點(diǎn)：基因克隆簡單：片斷小，一般為15－30bp，可以用DNA自動合成儀大量合成抑制靶基因的效率高：一個反義分子可以促進(jìn)多個mRNA的降解，同時在細(xì)胞中能夠自我擴(kuò)增，放大抑制效應(yīng)。缺點(diǎn)：在體細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，容易被核酸酶消化非特異性結(jié)合：容易與非互補(bǔ)鏈結(jié)合或與其他小分子物質(zhì)如蛋白結(jié)合降解產(chǎn)物對細(xì)胞的增殖或分化有抑制作用第六十六頁，共80頁。RNA干擾（RNAi）定義：雙鏈RNA對基因表達(dá)的阻斷作用作用機(jī)理：

通過一種小片段干擾性雙鏈RNA作為效應(yīng)分子催化與靶基因mRNA結(jié)合的級聯(lián)反應(yīng)而減少mRNA的含量，實(shí)際上就是通過細(xì)胞內(nèi)的PCR反應(yīng)大量擴(kuò)增干擾性RNA干擾目的基因的表達(dá)。主要通過正義鏈干擾。研究進(jìn)展：

非脊椎動物如線蟲，果蠅，以及植物中的應(yīng)用已經(jīng)取得了很多重要的成果，但在哺乳動物中的應(yīng)用還處于起步階段，在哺乳動物身上還沒有成功的實(shí)驗(yàn)報道。第六十七頁，共80頁。神經(jīng)系統(tǒng)基因治療轉(zhuǎn)染途徑即基因轉(zhuǎn)染的靶向性問題外周皮膚或粘膜注射：

距離遠(yuǎn)，轉(zhuǎn)染率低，以神經(jīng)元為靶細(xì)胞神經(jīng)核團(tuán)定點(diǎn)注射：

操作復(fù)雜、定點(diǎn)困難、創(chuàng)傷大。以神經(jīng)元為靶細(xì)胞腦脊液內(nèi)注射：

類似于臨床硬膜外鎮(zhèn)痛，這種方法轉(zhuǎn)染效果確實(shí)，操作方便，大多以神經(jīng)元周邊的腦膜細(xì)胞為靶細(xì)胞。第六十八頁，共80頁。轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率和療效研究

目的：轉(zhuǎn)染基因后細(xì)胞能夠高效、特異、長期的表達(dá)產(chǎn)物策略：改造轉(zhuǎn)基因載體：剔除即刻－早期基因組；改造外殼蛋白，提高對宿主細(xì)胞的親和力。選用特殊基因調(diào)控元件：選用高效啟動子或神經(jīng)元特異啟動子，增加轉(zhuǎn)染基因在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)抑制宿主免疫反應(yīng)：神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要是抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)第六十九頁，共80頁。基因調(diào)控元件的選擇強(qiáng)力啟動子：在多種細(xì)胞內(nèi)都能高效促進(jìn)基因表達(dá)，不具有細(xì)胞選擇性，因此，在載體不能進(jìn)入神經(jīng)元胞漿內(nèi)時，只能通過周邊細(xì)胞以旁分泌形式表達(dá)產(chǎn)物。例如RCMV和HCMV啟動子第七十頁，共80頁。靶向性啟動子和調(diào)控元件：只能在特異的細(xì)胞內(nèi)如神經(jīng)元內(nèi)啟動基因表達(dá)，在外周組織內(nèi)不表達(dá)，以自分泌形式發(fā)揮作用。例如人synapsin-1基因啟動子，大鼠特異烯醇酶(NSE)啟動子，神經(jīng)元特異的沉默子元件（NRSEs）可誘導(dǎo)性啟動子：通過藥物誘導(dǎo)啟動子功能達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。目前常用的有四環(huán)素（Teton/off）系統(tǒng)、利福平調(diào)控系統(tǒng)等?；蛘{(diào)控元件的選擇第七十一頁，共80頁?；蛑委煰熜в^察動物模型慢性炎性痛模型：

福爾馬林、鹿角菜膠、辣椒素炎性痛和福氏佐劑性關(guān)節(jié)炎模型慢性神經(jīng)痛模型：

坐骨神經(jīng)松捆扎、半結(jié)扎模型，脊神經(jīng)根結(jié)扎模型和脊髓損傷模型慢性腫瘤痛模型：結(jié)腸脹氣模型痛覺檢測方法行為學(xué)檢測：觀察動物的行為變化，模擬人類疼痛時情緒和行為反應(yīng)痛閾檢測：檢測冷熱刺激、機(jī)械刺激時外周痛閾的變化。第七十二頁，共80頁。安全性評估載體的毒性：病毒載體都具有