Lowrys法Folin-酚試劑法-測定血清中蛋白質的含量課件

怎樣測定血清中蛋白質的含量蛋白質含量測定的常用方法比較方法靈敏度優(yōu)點缺點凱氏定氮法0.2～1.0mg干擾少，準確操作復雜，費時紫外吸收法50～100mg快速簡便無損樣品靈敏度低干擾物較多考馬斯亮藍法（Bradford法）1～5ug靈敏、簡便、快速不同蛋白質測定時有較大的偏差雙縮脲法1～20mg干擾相對少，較快靈敏度低Lowry法20～250ug靈敏度高干擾物質多、費時、操作嚴格計時選擇測定方法時應考慮：1、實驗樣品對測定所要求的靈敏度和精確度；2、蛋白質的性質；3、溶液中存在的干擾物質；4、測定所花費的時間等。實驗目的1、掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質含量的原理及其實驗操作技術。2、掌握制作標準曲線的要領和通過標準曲線求樣品溶液中待測物質含量的方法。原理

1921年，F(xiàn)olin

首創(chuàng)，利用蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍色反應。

1951年，Lowry對此法進行了改進，先在標本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應，提高了靈敏度。原理第一步：雙縮脲反應

在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡合物,這個反應叫做雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有與雙縮脲結構相似的多個肽鍵,因此有雙縮脲反應。即在堿性溶液中，蛋白質分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質-Cu2+復合物。在一定濃度范圍內，藍色的深淺度與蛋白質濃度呈線性關系，故與同樣處理的蛋白質標準液比色即可求出蛋白質的含量。即根據(jù)預先繪制的標準曲線求出未知樣品中蛋白質的含量。原理樣品健康人血清正常人血清蛋白質含量：60~80g/L試劑1、牛血清白蛋白標準液（200μg/ml）2、堿性硫酸銅溶液（當日有效）3、Folin-酚試劑操作各管混勻，室溫放置10min。向各管內加入Folin-酚試劑0.20mL,2s內迅速混勻！40℃放置10min。冷卻至室溫后，以500nm波長比色，用1號管作空白，讀取各管吸光度。試劑（ml)123456牛血清白蛋白標準液-0.200.400.600.80-樣品液（稀釋300倍）-----0.50蒸餾水1.00.800.600.400.200.50堿性硫酸銅2.02.02.02.02.02.0蛋白質濃度（μg/ml）04080120160？？注意事項Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質作用生成堿性的銅-蛋白質溶液。故當Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。

注意事項因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。即第1支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20mLFolin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20mLFolin-酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。水浴10min，流水冷卻后，每1分鐘拿出一管，測吸光值。蛋白樣品堿性銅試劑混勻，放10min加酚試劑2s混勻水浴10min放至室溫比色繪制標準曲線步驟1、選擇合適的坐標紙2、畫坐標軸3、根據(jù)測得的數(shù)據(jù)描點4、連線5、求實驗結果繪制標準曲線以A500值為縱坐標，牛血清白蛋白標準液濃度為橫坐標，用鉛筆繪制標準曲線。吸光度A蛋白質濃度C（μg/ml）0.20.40.6....4080120160繪制標準曲線要求：根據(jù)所描點的分布情況，作直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實驗點的平均變動情況，因此該線不需全部通過各點，但應盡量使未經過線上的實驗點均勻分布在曲線或直線兩側。本方法的特點：優(yōu)點：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍；2.操作簡單，不需特殊儀器設備。缺點：1.操作時間較長，要精確控制操作時間；2.標準曲線不是嚴格的直線形式；3.專一性較差，干擾物質較多。

復習思考題1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點？2、應用本方法有哪些干擾作用？為什么？應如何注意？

請將答案附在實驗報告上！V-1100分光光度計操作步驟開機，預熱30分鐘；轉動波長旋鈕，調所需波長。按鍵切換到T檔；將黑體放入光路中，合上蓋，按鍵校零；開蓋，將參比液按空白液、標準液、待測液的順序放入比色杯架上，合上蓋，按鍵切換到A檔；拉動比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋，按鍵校零；拉動拉桿，將標準