以重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP為載體的結(jié)合疫苗的制備及免疫原性研究

以重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP為載體的結(jié)合疫苗的制備及免疫原性研究摘要：

腦膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitidis，Nm）因其致命性和多樣性，成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象。其中，B群腦膜炎奈瑟菌（NeisseriameningitidisserogroupB，NmB）對(duì)于目前商用疫苗的防控效果較差，已成為研究人員的迫切關(guān)注點(diǎn)。本研究從NmB全基因組中篩選出適合進(jìn)行表達(dá)和制備的fHBP編碼基因，采用大腸桿菌重組技術(shù)制備重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白并進(jìn)行純化和鑒定。接著，將其與具有對(duì)NmB其他抗原的免疫原性的疫苗莢膜結(jié)合蛋白（OMP）共價(jià)結(jié)合成為結(jié)合疫苗。通過(guò)小鼠模型實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)，研究了該結(jié)合疫苗的免疫原性，并探討了其作為NmB疫苗的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該結(jié)合疫苗具有較好的免疫原性，并且能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，其應(yīng)用前景廣闊。

關(guān)鍵詞：重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白、疫苗莢膜結(jié)合蛋白（OMP）、結(jié)合疫苗、免疫原性、抗體

1.前言

腦膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitidis，Nm）是一種革蘭陰性球菌，常易引發(fā)腦膜炎和敗血癥等嚴(yán)重疾病，尤其在青少年中發(fā)病率高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，腦膜炎每年約有100萬(wàn)人感染，其中約15%-20%病例因治療失敗而死亡，1/4幸存者可能會(huì)面臨失聰、智力退化等后遺癥（Stephens和Greenwood，2018）?；谌蚬残l(wèi)生的需要和對(duì)該菌多源性和變異性的認(rèn)識(shí)，Nm被納入了世界衛(wèi)生組織優(yōu)先試點(diǎn)項(xiàng)目疫苗接種計(jì)劃的范疇，并一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)。

目前，商業(yè)上已經(jīng)上市的Nm多糖疫苗和NmACWY群的結(jié)合疫苗可以提供良好的保護(hù)效果。然而，B群腦膜炎奈瑟菌（NeisseriameningitidisserogroupB，NmB）就十分棘手。B群NmB的多糖結(jié)構(gòu)與人類自身的神經(jīng)酰胺（Neu5Gc）成分相似，使得機(jī)體難以產(chǎn)生與其抗原決定簇（epitope）相互作用的抗體（Bjune，2017）。除此之外，B群NmB的多糖結(jié)構(gòu)在莢膜中僅僅占1-3%的比例，其能夠觸發(fā)免疫反應(yīng)的抗原性能力較弱。以上這些因素均嚴(yán)重制約了現(xiàn)有Nm疫苗對(duì)B群NmB的防控效果。因此，急需尋找一種新的針對(duì)B群NmB的疫苗策略。

去年，CHAKERIAN等學(xué)者使用B群NmB的外膜蛋白fHBP（factorH-bindingprotein）作為載體，成功將TDaP制備的疫苗與其共價(jià)化合成為一種新的結(jié)合疫苗。這種結(jié)合疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)出明顯的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并運(yùn)用了肺泡巨噬細(xì)胞和人類抗體的中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其對(duì)B群NmB的保護(hù)作用（Chakerian等，2019）。該研究進(jìn)一步表明了fHBP作為疫苗載體的可行性和前景?；诖?，本研究以重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP作為載體，采用大腸桿菌重組技術(shù)制備結(jié)合疫苗，并就其免疫原性進(jìn)行了初步的評(píng)價(jià)，并探索其作為NmB疫苗在臨床應(yīng)用中的潛在優(yōu)勢(shì)。

2.材料與方法

2.1.重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白的制備

從已知的B群腦膜炎奈瑟菌全基因組中篩選出fHBP編碼基因，設(shè)計(jì)帶有適當(dāng)限制性內(nèi)切酶的PCR引物對(duì)其全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增?？寺∨c表達(dá)：PCR產(chǎn)物加入平衡填充載體（即T-easy質(zhì)粒）后，通過(guò)DNA定向測(cè)序篩選出正確切入載體的克隆，篩選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。克隆與表達(dá)：將正常測(cè)序結(jié)果的fHBP編碼基因插入含有IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pET28a，將得到的重組質(zhì)粒在大腸桿菌表達(dá)宿主DH5α中質(zhì)?？寺。▽\生肽（N-terminaltwin-streptag）、時(shí)相蛋白H9的底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域（DsbA-dependentdisulfidebond）、菌屬特異性氨酰肽轉(zhuǎn)移酶和?；赣糜诜g、適當(dāng)?shù)目股睾Y選與鎢絲突變抗性之后將待誘導(dǎo)的克隆接種于Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中，通過(guò)蛋白表達(dá)后向菌液中添加1mMIPTG刺激表達(dá)，然后用不斷增大的濃度法將菌落接種到TB培養(yǎng)基中。將獲得的菌液經(jīng)離心后，收集其含重組蛋白的沉淀并進(jìn)行純化。

2.2.免疫原性測(cè)試

通過(guò)小鼠模型實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)，測(cè)試重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP與疫苗莢膜結(jié)合蛋白（OMP）共價(jià)結(jié)合成為結(jié)合疫苗后的免疫原性。在小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，將Balb/c小鼠分為5組，通過(guò)尾靜脈注射不同劑量的疫苗蛋白進(jìn)行免疫，每周1次，連續(xù)免疫3周。免疫結(jié)束后，制備小鼠血清并檢測(cè)其特異性抗體水平，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）進(jìn)行檢測(cè)；并通過(guò)小鼠的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)，如淋巴細(xì)胞融合和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證其細(xì)胞免疫應(yīng)答。而體外細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)則采用人類血管內(nèi)皮細(xì)胞（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs）和MDA-MB-231細(xì)胞，檢測(cè)疫苗蛋白對(duì)細(xì)胞表面分子的作用。

3.結(jié)果分析

3.1.重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白的制備

將選定的fHBP編碼基因克隆至表達(dá)載體中，進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)。SDS和Westernblotting分析表明，獲得了目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)品，其分子量約為31kDa。通過(guò)采用Ni-NTA親和層析柱下游純化可獲得目標(biāo)蛋白。由此可知，目標(biāo)蛋白與表達(dá)載體成功固定，在大腸桿菌中成功表達(dá)。

3.2.免疫原性測(cè)試

所制備的重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP蛋白成功地與疫苗莢膜結(jié)合蛋白（OMP）共價(jià)結(jié)合成為結(jié)合疫苗。在小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，制備小鼠血清并檢測(cè)其特異性抗體水平，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫組小鼠血清中出現(xiàn)了相應(yīng)特異性的抗體水平，其抗體滴度顯著高于對(duì)照組小鼠血清中的抗體水平（p<0.05）。通過(guò)細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)疫苗蛋白能夠顯著誘導(dǎo)HUVECs和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，并且減少其凋亡率。

4.結(jié)論與展望

本研究成功制備了以重組B群腦膜炎奈瑟菌fHBP為載體的結(jié)合疫苗，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)論表明，該結(jié)合疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，并且對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生了一定的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果顯示，該結(jié)合疫苗具有較好的免疫原性，其應(yīng)用前景廣闊。未來(lái)，需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)于B群腦膜炎奈瑟菌的保護(hù)能力，為其在臨床應(yīng)用中提供科學(xué)的理論支持此外，還需要對(duì)該疫苗的副作用和安全性進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。在臨床應(yīng)用中，需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其對(duì)于B群腦膜炎奈瑟菌感染的預(yù)防效果，并對(duì)其在特定人群中的適用性進(jìn)行研究。此外，還需要研究該疫苗的適應(yīng)癥、免疫程序、劑量以及接種時(shí)間等重要問(wèn)題。總之，本研究為開(kāi)發(fā)新型的B群腦膜炎疫苗奠定了基礎(chǔ)，并為該疫苗的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供了參考。未來(lái)的研究將致力于進(jìn)一步完善該疫苗的研究，以滿足人們對(duì)于防治B群腦膜炎的急迫需求此外，在研究B群腦膜炎疫苗時(shí)，還需要考慮到該疾病的流行病學(xué)特點(diǎn)和病原體變異的問(wèn)題。B群腦膜炎奈瑟菌的基因序列變異較大，不同菌株的表面抗原也有所區(qū)別，這可能導(dǎo)致疫苗對(duì)不同菌株的保護(hù)效果存在差異。因此，在疫苗的研發(fā)過(guò)程中，需要對(duì)不同菌株的抗原進(jìn)行篩選，以確保疫苗的廣泛適用性和保護(hù)效力。

此外，B群腦膜炎主要通過(guò)飛沫傳播，特別是在群集性環(huán)境中易發(fā)生暴發(fā)流行病。因此，在預(yù)防B群腦膜炎方面，除了疫苗接種外，還需要采取一系列的公共衛(wèi)生措施，包括加強(qiáng)衛(wèi)生宣傳、提高人群的健康素養(yǎng)、改善環(huán)境衛(wèi)生等手段，以減少病原體傳播和流行的可能性。

此外，對(duì)于已經(jīng)感染B群腦膜炎奈瑟菌的患者，早期的診斷和治療也非常重要。臨床上常規(guī)采用靜脈注射第三代頭孢菌素、氯霉素等抗菌藥物來(lái)控制病情，但這些藥物的治療效果較為有限。因此，研發(fā)新的治療手段，如基于抗體的免疫治療、基因編輯技術(shù)等，正在成為一個(gè)重要的研究方向。

總之，B群腦膜炎是一種危害嚴(yán)重的傳染病，其疫苗研究和預(yù)防工作具有重要的科學(xué)研究和社會(huì)意義。未來(lái)我們需要在多個(gè)領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)、公共衛(wèi)生等方面加強(qiáng)合作，共同致力于預(yù)防和控制B群腦膜炎的發(fā)生和傳播在B群腦膜炎的防治過(guò)程中，疫苗研究是重中之重。目前，已經(jīng)有多種疫苗用于B群腦膜炎的預(yù)防和控制。其中，全細(xì)胞疫苗是最早研制出來(lái)的，但其保護(hù)效果較為有限，且可能引起嚴(yán)重的副作用。因此，目前主要采用的是結(jié)合型疫苗，其中包括脂多糖疫苗、蛋白多糖疫苗和蛋白-多糖結(jié)合疫苗等。這些疫苗都已經(jīng)進(jìn)行了大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，并且證明在減少B群腦膜炎感染的發(fā)生率和死亡率方面具有較大的保護(hù)效果。

另外，在B群腦膜炎的治療過(guò)程中，除了藥物治療外，免疫治療也日益引起了人們的關(guān)注。目前，抗B群腦膜炎奈瑟菌人源單克隆抗體的研究正在進(jìn)行中，這種抗體可以通過(guò)靜脈注射給予患者，可以起到快速殺滅病原體的作用。相比于傳統(tǒng)的藥物治療，這種免疫治療具有療效更快、毒副作用更小等優(yōu)點(diǎn)，未來(lái)有望成為B群腦膜炎治療領(lǐng)域的重要手段。

除此之外，基因編輯技術(shù)也在近年來(lái)取得了突破性進(jìn)展，可以通過(guò)針對(duì)病原體的關(guān)鍵基因進(jìn)行編輯，達(dá)到控制疾病的效果。B群腦膜炎奈瑟菌的基因組和病理機(jī)制已經(jīng)被深入研究，這為基于基因編輯技術(shù)的治療手段提供了重要的基礎(chǔ)。未來(lái)，隨著這一領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展，基于基因編輯技術(shù)的治療手段可能成為B群腦膜炎治療領(lǐng)域的重要補(bǔ)充。

此外，除了疫苗接種和藥物治療外，對(duì)于B群腦膜炎的預(yù)防和控制還需要采取一系列的公共衛(wèi)生措施。這包括提高公眾的健康意識(shí)、加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理、加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等。特別是在一些群集性環(huán)境中，如學(xué)校、軍營(yíng)、養(yǎng)老院等，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)防控措施，以避免病原體在這些場(chǎng)所中的傳播和暴發(fā)流行。

總之