工程科技發(fā)酵培養(yǎng)基

工程科技發(fā)酵培養(yǎng)基第1頁/共82頁第三章發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細胞生長所需的一組營養(yǎng)物質和原料。同時培養(yǎng)基也為微生物培養(yǎng)提供除營養(yǎng)外的其它所必須的條件。發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：

滿足菌體的生長促進產(chǎn)物的形成第2頁/共82頁發(fā)酵培養(yǎng)基的要求①滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟的合成。②發(fā)酵后所形成的副產(chǎn)物盡可能的少。③培養(yǎng)基的原料應因地制宜，價格低廉；且性能穩(wěn)定，資源豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模儲藏，能保證生產(chǎn)上的供應。④所選用的培養(yǎng)基應能滿足總體工藝的要求，如不影響通氣、提取、純化及廢物處理等。第3頁/共82頁第一節(jié)培養(yǎng)基的類型及功能培養(yǎng)基按其組成物質的純度、狀態(tài)、用途可分為三大類型

一、按純度合成培養(yǎng)基:原料其化學成分明確、穩(wěn)定

適合于研究菌種基本代謝和過程的物質變化規(guī)律

培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)天然培養(yǎng)基:采用天然原料

原料來源豐富(大多為農(nóng)副產(chǎn)品)、價格低廉、適于工業(yè)化生產(chǎn)

原料質量等方面不加控制會影響生產(chǎn)穩(wěn)定性第4頁/共82頁M培養(yǎng)基(1L)：

Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10,pH7.0YPS培養(yǎng)基：酪蛋白胨10g，酵母提取物5g,NaCl10g，PH7.2培養(yǎng)大腸桿菌常用兩種培養(yǎng)基第5頁/共82頁二、按狀態(tài)固體培養(yǎng)基:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。三、按用途（從發(fā)酵生產(chǎn)應用考慮）

培養(yǎng)基按其用途可分為孢子（斜面）培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種第6頁/共82頁第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源一、碳源1、作用

提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分；

提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分。2、來源糖類、油脂、有機酸、低碳醇第7頁/共82頁3、工業(yè)上常用的糖類①葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖但是會引起葡萄糖效應

工業(yè)上常用淀粉水解糖，但是糖液必須達到一定的質量指標第8頁/共82頁葡萄糖效應:

分解代謝產(chǎn)物阻遏某些誘導酶體系編碼的基因轉錄的現(xiàn)象。

如大腸桿菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上，葡萄糖未被利用完之前，乳糖操縱子就一直被阻遏，乳糖不能被利用。

原因：葡萄糖的分解物引起細胞內(nèi)cAMP含量降低，啟動子釋放cAMP-CAP（catabolicgeneactivatorprotein）蛋白，RNA聚合酶不能與乳糖的啟動基因結合，導致轉錄不能進行，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操縱子才進行轉錄，形成利用乳糖的酶。

第9頁/共82頁不同的制糖工藝生產(chǎn)的糖液質量差別很大第10頁/共82頁②糖蜜糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。第11頁/共82頁不用加工方法對甘蔗糖蜜的影響第12頁/共82頁糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質，其中有些是有用的，但許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需進行預處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結晶）、鈣鹽（結晶）

生物素（發(fā)酵控制）預處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質：鐵離子含量高（導致異檸檬酸的生成）預處理：→黃血鹽K4Fe(CN)6·3H2O

第13頁/共82頁③淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的α-淀粉酶成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格底可以解除葡萄糖效應第14頁/共82頁例：地衣牙孢桿菌生產(chǎn)α-淀粉酶碳源對生長和產(chǎn)酶的影響碳源細胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2第15頁/共82頁李江華，無錫輕工大學學報，2004(1.5g麩皮)第16頁/共82頁二、氮源

氮源主要用于構成菌體細胞物質（氨基酸，蛋白質、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。1、無機氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH

第17頁/共82頁

無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質的無機氮源叫生理酸性物質，如硫酸胺；若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質的則此種無機氮源稱為生理堿性物質，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質，對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。所以選擇合適的無機氮源有兩層意義：

滿足菌體生長穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH第18頁/共82頁毛霉產(chǎn)蛋白酶的研究陳濤，中國釀造，2004初始pH的影響:pH偏酸比較好，中性蛋白酶影響大第19頁/共82頁無機氮源的影響：硫酸銨>硝酸銨>硝酸鈉>尿素第20頁/共82頁2、有機氮源來源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟。成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：

①可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等第21頁/共82頁

有機氮源成分復雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響！第22頁/共82頁氮源使用的一些相關問題：

有機氮源和無機氮源應當混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質

有些產(chǎn)物會受氮源的誘導和阻遏例：蛋白酶的生產(chǎn)

有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力

開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣的課題第23頁/共82頁第24頁/共82頁三、無機鹽和微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定4、使用注意點A.對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮第25頁/共82頁例：鐵離子

青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml發(fā)酵罐必須進行表面處理B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲霉NRRL-330，產(chǎn)α-淀粉酶，pH對酶活的影響

pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘第26頁/共82頁四、生長因子、前體和產(chǎn)物促進劑

從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等。1、生長因子

如：以糖質原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子,生長因子對發(fā)酵的調(diào)控起到重要的作用。

有機氮源是這些生長因子的重要來源，多數(shù)有機氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子。第27頁/共82頁

前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。2、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136第28頁/共82頁作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份用量：前體的用量可以按分子量衡算，具體使用有個轉化率的問題例：6000單位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素0.6微克＝1U鏈霉素、卡那霉素、紅霉素等定義活性部分1μg=1u金霉素、四環(huán)素的鹽酸鹽定一為1μg＝1u制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u第29頁/共82頁作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份用量：前體的用量可以按分子量衡算，具體使用有個轉化率的問題例：6000單位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝3.6mg/ml

苯乙酸＝（3.6*136）/356=1.38mg/ml=0.138%實際使用時的轉化率在46-90%之間例某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素）轉化率為：13.8/[(0.337/0.6)*36]=68%第30頁/共82頁用法：前體使用時普遍采用流加的方法前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利。苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加0.07%

前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，流加也有利于提高前提的轉化率第31頁/共82頁3、產(chǎn)物促進劑

所謂產(chǎn)物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。第32頁/共82頁

促進劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進劑本身是酶的誘導物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)，也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。第33頁/共82頁五、水

對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。

水源質量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻

對于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。第34頁/共82頁第三節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化

目前還不能完全從生化反應的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學、細胞生物學、微生物學等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設備，按照一定的實驗設計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。第35頁/共82頁一、培養(yǎng)基成分選擇的原則

菌種的同化能力

代謝、阻遏和誘導

合適的C、N比100∶0.2～2.0

pH的要求

第36頁/共82頁（一）、理論轉化率與實際轉化率

理論轉化率是指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進行物料衡算，所得出的轉化率的大小。實際轉化率是指實際發(fā)酵過程中轉化率的大小

如何使實際轉化率接近于理論轉化是發(fā)酵控制的一個目標

二、成分含量的確定第37頁/共82頁例:

如在酒精生產(chǎn)中葡萄糖轉化為酒精的理論轉化率計算如下∶

葡萄糖轉化為酒精的代謝總反應衡算式為∶

C6H12O6─→2C2H5OH+2CO2

葡萄糖轉化為酒精的理論得率為∶

2*46

Y=───=0.51180第38頁/共82頁第39頁/共82頁③當培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數(shù)常采用一些合理的實驗設計方法。（二）、培養(yǎng)基設計的步驟①根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；

培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過實驗獲得的第40頁/共82頁多因子實驗：均勻設計、正交實驗設計、響應面分析等。

通過對響應面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間函數(shù)關系的一種統(tǒng)計方法。第41頁/共82頁類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健第42頁/共82頁原培養(yǎng)基:第43頁/共82頁

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)第44頁/共82頁

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度2%比較好第45頁/共82頁結果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機鹽:復合無機鹽0.05%第46頁/共82頁

正交設計確定優(yōu)化的配方第47頁/共82頁R1.6420.3992.2090.514第48頁/共82頁改進后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基改進后培養(yǎng)基的發(fā)酵結果第49頁/共82頁三、搖瓶水平到反應器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應器培養(yǎng)基研究的兩個層次

搖瓶——培養(yǎng)基設計的第一步

反應器—最終的優(yōu)化的基礎配方第50頁/共82頁例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

輕質碳酸鈣1%發(fā)酵罐:葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8%，補加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎培養(yǎng)差別很大第51頁/共82頁搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應器研究的基礎第52頁/共82頁發(fā)酵罐：反應器水平,

可以得出最終優(yōu)化的基礎配方第53頁/共82頁pH控制搖床：反應器水平上的搖瓶研究第54頁/共82頁pH控制搖床在1,3-丙二醇發(fā)酵中的應用第55頁/共82頁1,3-丙二醇的用途：

最重要的用途是作為單體與對苯二甲酸丙二醇聚合生產(chǎn)聚酯聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)

可作為增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑等用于食品、化妝品和制藥等工業(yè)第56頁/共82頁PTTPET滌綸Nylon尼龍、錦綸Acrylic亞克力Spandex(Lycra)萊卡、氨綸柔韌度++-++NA彈性+-----++豐滿度++----+NA磨損++++---抗污染力++++------洗滌牢度++++------日曬牢度++-++--抗靜電力++++----NA色彩密度----+++--成本---++-+--PTT最目前性能最好的纖維被譽為21世紀的大型纖維PTT的性能第57頁/共82頁1,3-丙二醇兩步發(fā)酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母伯氏肺炎桿菌、丁酸梭菌等第58頁/共82頁伯氏肺炎桿菌1,3-丙二醇的代謝甘油三羥基丙醛1,3-丙二醇二羥丙酮丙酮酸乙酸乙醇乳酸丁醇丁酸丁二醇2HH2OpH下降厭氧過程、pH下降2H第59頁/共82頁不同pH條件對甘油消耗的影響第60頁/共82頁搖瓶培養(yǎng)基分批培養(yǎng)過程結果第61頁/共82頁補料培養(yǎng)過程甘油

濃度為3.43%，對甘油轉化率為19%第62頁/共82頁1,3-丙二醇的濃度5.37%，轉化率為40%進一步優(yōu)化培養(yǎng)基后過程第63頁/共82頁1,3-丙二醇的濃度為6.72%，對甘油轉化率為54.7%，生產(chǎn)強度為1.9g/L.h。進一步優(yōu)化條件后第64頁/共82頁五、培養(yǎng)基設計時注意的一些相關問題

原料及設備的預處理

原材料的質量

發(fā)酵特性的影響

在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中往往喜歡所謂的“稀配方”，因為它既降低成本、滅菌容易、且使氧傳遞容易而有利于目的產(chǎn)物的生物合成。如果營養(yǎng)成分缺乏，則可通過中間補料方法予以彌補。第65頁/共82頁

滅菌

在大規(guī)模發(fā)酵中應該盡可能的采取連續(xù)滅菌的操作，而且保證滅菌條件的穩(wěn)定是保證發(fā)酵穩(wěn)定的前提

有時避免營養(yǎng)物質在加熱的條件下，相互作用，可以將營養(yǎng)物質分開消毒。

有些物質由于揮發(fā)和對熱非常敏感，就不能采用濕熱的滅菌方法

Na2HPO4+CaCO3→CaHPO4+Na2CO3第66頁/共82頁第四節(jié)、重組產(chǎn)品培養(yǎng)基的介紹

大腸桿菌高密度度培養(yǎng)：碳源：葡萄糖、甘油氮源：胰蛋白胨、酵母粉無機鹽：磷、鎂等第67頁/共82頁蛋白胨、酵母粉(OXOID)章越，生物工程學報，2004第68頁/共82頁

動物細胞培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基:F12、DMEM等血清(5-10%)：胎牛(FBS)、小牛(CS)、馬(HS)水：超純水其它：NaHCO3（CO2）、抗生素第69頁/共82頁GONG,J.B.B.2003第70頁/共82頁本章小節(jié)：

培養(yǎng)基—菌體生長所需的營養(yǎng)以及其它必須的條件

了解發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，發(fā)酵培養(yǎng)基常用的原料以及其中的基本概念

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化與設計是發(fā)酵工程的基本問題，掌握發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化與設計的思路、了解其中的方法第71頁/共