演示文稿第五章目的基因的獲取

演示文稿第五章目的基因的獲取現(xiàn)在是1頁\一共有103頁\編輯于星期六第五章目的基因的獲取ppt課件現(xiàn)在是2頁\一共有103頁\編輯于星期六第五章目的基因的獲取目的基因：準備要分離、改造、擴增或表達的基因?，F(xiàn)在是3頁\一共有103頁\編輯于星期六第一節(jié)

基因組DNA片段化一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片段。酶切現(xiàn)在是4頁\一共有103頁\編輯于星期六由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。1.優(yōu)點2.缺點目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene現(xiàn)在是5頁\一共有103頁\編輯于星期六二、隨機片段化1.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。①內(nèi)切酶識別位點的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機程度。（1）限制性內(nèi)切酶的選用原則現(xiàn)在是6頁\一共有103頁\編輯于星期六1）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個切點。2）6bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個切點。隨機程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點相連。（Sau3A—BamHI）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHI5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A(同尾酶)現(xiàn)在是7頁\一共有103頁\編輯于星期六2.機械切割法（1）超聲波超聲波強烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片段。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片段?，F(xiàn)在是8頁\一共有103頁\編輯于星期六1976年H.G.Khorana提出了用化學方法合成基因的設想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。第二節(jié)

化學合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動化合成法。現(xiàn)在是9頁\一共有103頁\編輯于星期六①

保護dNTP的3’端P和5’端–OH（1）原理1.磷酸二酯法保證合成反應的定向進行。起始脫氧單核苷酸

加入的脫氧單核苷酸現(xiàn)在是10頁\一共有103頁\編輯于星期六②

帶保護的單核苷酸連接帶5’保護的單核苷酸與帶3’保護的另一個單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來現(xiàn)在是11頁\一共有103頁\編輯于星期六③

用酸或堿的脫保護80%乙酸現(xiàn)在是12頁\一共有103頁\編輯于星期六（2）合成過程下一個5’端保護的單核苷酸又可以同3’端保護的二核苷酸聚合?，F(xiàn)在是13頁\一共有103頁\編輯于星期六原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個保護基團。2.磷酸三酯法現(xiàn)在是14頁\一共有103頁\編輯于星期六

將第一個核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。

固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵！現(xiàn)在是15頁\一共有103頁\編輯于星期六固相磷酸三酯合成過程固相支持物結(jié)果是全保護的DNA：5’DMT(4，4-二對甲氧基三苯甲基

),3’固相支持物,核苷酸之間對氯苯。最后脫保護固相支持物固相支持物C現(xiàn)在是16頁\一共有103頁\編輯于星期六目前化學合成寡核苷酸大多數(shù)是在合成儀上自動進行的，DNA自動合成已采用的是固相磷酸二酯法和亞磷酸三酯法，由于亞磷酸三酯法具有反應速度快，合成效率高和副反應極少等優(yōu)點，已經(jīng)在自動合成儀被廣泛采用。現(xiàn)在是17頁\一共有103頁\編輯于星期六3、亞磷酸三酯法(1)脫二苯甲基保護基加入ZnBr2或二氯乙酸，脫去4，4—二對甲氧基三苯甲基，釋放出與載體相連的寡聚核苷酸單體1上的5’—OH。(2)活化新的堿基核苷酸單體2的3’端的二異丙基亞磷酸酰上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保護，準備和前一個堿基進行反應。現(xiàn)在是18頁\一共有103頁\編輯于星期六(3)縮合反應在弱強——四唑的存在下，新加入帶保護基的核苷酸單體2與單體1發(fā)生縮合反應，形成3’，5’—磷酸二酯鍵，其中，磷為3價，即形成了亞磷酸三酯中間產(chǎn)物。(4)蓋帽反應加入乙酸酐，使極少數(shù)尚未參加縮合反應的核苷酸單體1中的5’—OH乙?；?，從而達到封閉的作用，終止其以后參加縮臺反應的可能性，以減少發(fā)生合成錯誤的機會。(5)氧化反應形成的3’一5’磷酸二酯鍵由于磷為3價，即亞磷酸酯，不穩(wěn)定，能被酸或堿解離。加入I2將其氧化，使之轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，其中磷為5價?，F(xiàn)在是19頁\一共有103頁\編輯于星期六三價五價現(xiàn)在是20頁\一共有103頁\編輯于星期六如此經(jīng)過多次循環(huán)，直到合成所需長度為止，再用濃NH4OH將DNA從固相上洗脫下來，最后除去NH4OH，在真空中抽干，樣品即可溶于適量的水中進行純化分析。

要注意的問題:合成方向3’→5’核苷酸單體的磷酸基團在3’端亞磷酸三酯法的磷為3價磷，需要氧化?，F(xiàn)在是21頁\一共有103頁\編輯于星期六化學合成的DNA片段一般在200bp以內(nèi)。二、

化學合成DNA片段的組裝用T4多核苷酸激酶使各個片段的5’端帶上磷酸。1.互補連接法預先設計合成的片段之間都有互補區(qū)域，不同片段之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。（2）5’端磷酸化（1）互補配對（合成的DNA單鏈的5’端是-OH）現(xiàn)在是22頁\一共有103頁\編輯于星期六T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈現(xiàn)在是23頁\一共有103頁\編輯于星期六2.互補延伸連接法預先設計的片段之間有局部互補區(qū)，可以相互作為另一個片段延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3’

5’

5’

3’

5’

3’

T4DNA連接酶Klenow片段引物現(xiàn)在是24頁\一共有103頁\編輯于星期六1.直接合成基因三、

寡聚核苷酸化學合成的優(yōu)點2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA

3.合成探針序列4.定點突變合成合成帶有定點突變的基因片段。（2）有些基因比較短，化學合成費用較低現(xiàn)在是25頁\一共有103頁\編輯于星期六DNA合成儀5.合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor銜接物用化學合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的平端雙鏈。人工接頭用化學合成法合成的一段不等長雙鏈DNA序列，一頭平末端、另一頭粘性末端，粘性末端某種酶切所產(chǎn)生的粘性末端）。AATTCGGAATTC

CTTAAG現(xiàn)在是26頁\一共有103頁\編輯于星期六

將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片段，并將所有這些片段都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。

理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。一、基因文庫的構建1.基因文庫（genelibrary）第三節(jié)

目的基因的保存和擴增現(xiàn)在是27頁\一共有103頁\編輯于星期六（2）目前常用的載體

2.構建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片段大小直接影響到構建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片段數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對載體的要求載體系列：

容量為

24kpcosmid載體：

容量為

50kbYAC：

容量為

1MbBAC:容量為

300kb現(xiàn)在是28頁\一共有103頁\編輯于星期六斷點完全隨機，片段長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備3.基因文庫構建的一般步驟超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。

①

物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片段。②

酶切法：現(xiàn)在是29頁\一共有103頁\編輯于星期六（2）載體與基因組DNA大片段的連接①

粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片段?，F(xiàn)在是30頁\一共有103頁\編輯于星期六各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾現(xiàn)在是31頁\一共有103頁\編輯于星期六現(xiàn)在是32頁\一共有103頁\編輯于星期六4.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片段的平均長度占整個基因組DNA的百分數(shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）ln以e為底的對數(shù)現(xiàn)在是33頁\一共有103頁\編輯于星期六例如：人的基因組是

3×109bp，插入DNA片段的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大??；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105現(xiàn)在是34頁\一共有103頁\編輯于星期六1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。2.cDNAlibrary二、

cDNA文庫的構建mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫?，F(xiàn)在是35頁\一共有103頁\編輯于星期六（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構建。4.構建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫的特點提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）?，F(xiàn)在是36頁\一共有103頁\編輯于星期六分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化Column（柱）現(xiàn)在是37頁\一共有103頁\編輯于星期六現(xiàn)在是38頁\一共有103頁\編輯于星期六反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物現(xiàn)在是39頁\一共有103頁\編輯于星期六用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一鏈3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH堿現(xiàn)在是40頁\一共有103頁\編輯于星期六剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

③cDNA第二鏈合成現(xiàn)在是41頁\一共有103頁\編輯于星期六④去掉發(fā)卡結(jié)構核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

5’

3’

現(xiàn)在是42頁\一共有103頁\編輯于星期六現(xiàn)在是43頁\一共有103頁\編輯于星期六這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片段。妙用RNaseH小片段正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片段。DNAPolI除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。現(xiàn)在是44頁\一共有103頁\編輯于星期六mRNAcDNA3’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

5’

引物mRNAcDNA第一鏈3’

5’

mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’

5’

RNaseHDNAligase去引物現(xiàn)在是45頁\一共有103頁\編輯于星期六現(xiàn)在是46頁\一共有103頁\編輯于星期六在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶現(xiàn)在是47頁\一共有103頁\編輯于星期六現(xiàn)在是48頁\一共有103頁\編輯于星期六6.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n現(xiàn)在是49頁\一共有103頁\編輯于星期六三、文庫的查詢（screening）用目的基因探針與文庫中的重組載體進行Southernblot雜交。文庫載體探針電泳后雜交放射自顯影測序分析現(xiàn)在是50頁\一共有103頁\編輯于星期六第四節(jié)

目的基因的分離和擴增一、從mRNA分離目的基因1.探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板?，F(xiàn)在是51頁\一共有103頁\編輯于星期六纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過柱與探針堿基互補的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR現(xiàn)在是52頁\一共有103頁\編輯于星期六2.mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）現(xiàn)在是53頁\一共有103頁\編輯于星期六從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和分離總mRNA。將表達A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達的A基因的cDNA單鏈。用羥基磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序?，F(xiàn)在是54頁\一共有103頁\編輯于星期六AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥基磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥基磷灰石柱BAcDNA文庫現(xiàn)在是55頁\一共有103頁\編輯于星期六3.mRNA差異顯示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端的錨定引物Oligo(dT)引物的3’端加兩個核苷酸（倒數(shù)第二個不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

現(xiàn)在是56頁\一共有103頁\編輯于星期六（2）12種錨定引物AGTTTTTTTT5’

3’

CGTTTTTTTT5’

3’

GGTTTTTTTT5’

3’

TGTTTTTTTT5’

3’

AATTTTTTTT5’

3’

CATTTTTTTT5’

3’

GATTTTTTTT5’

3’

TATTTTTTTT5’

3’

ACTTTTTTTT5’

3’

CCTTTTTTTT5’

3’

GCTTTTTTTT5’

3’

TCTTTTTTTT5’

3’

現(xiàn)在是57頁\一共有103頁\編輯于星期六（3）5’端的隨機引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

擴增cDNA。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNNNN5’

3’

cDNA第二鏈，并PCR現(xiàn)在是58頁\一共有103頁\編輯于星期六（4）隨機引物與錨定引物成對擴增12種錨定引物，若與20種隨機引物，可組成240組引物。引物組合：240組在能分出20000多條帶！實驗結(jié)果：如果每條帶相當于一種mRNA，20000mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部的mRNA。在測序膠上，每組擴出50-100條長度為100-500bp的帶?，F(xiàn)在是59頁\一共有103頁\編輯于星期六（5）隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇有差異的帶，進一步PCR作探針。篩選文庫，找到差別基因的全長序列?，F(xiàn)在是60頁\一共有103頁\編輯于星期六二、PCR技術獲得目的基因1.直接從基因組中擴增（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)已知目的基因序列設計引物（3）PCR擴增真核生物基因組含有內(nèi)含子！適合擴增原核生物基因。(一)已知目的基因序列現(xiàn)在是61頁\一共有103頁\編輯于星期六原核基因組部分原核細胞提取基因組DNAPCR擴增現(xiàn)在是62頁\一共有103頁\編輯于星期六（1）提取基因組

totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴增（3）根據(jù)已知目的基因序列設計引物2.從mRNA中擴增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴增真核生物基因?，F(xiàn)在是63頁\一共有103頁\編輯于星期六目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的

基因cDNA第二鏈PCRmRNA現(xiàn)在是64頁\一共有103頁\編輯于星期六(二)未知目的基因序列（1）反向PCR擴增兩個引物外側(cè)的未知序列把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。templatetemplate3’

5’

5’

3’

（傳統(tǒng)PCR只擴增兩個引物質(zhì)之間的已知序列）。技術關鍵：現(xiàn)在是65頁\一共有103頁\編輯于星期六使引物的外側(cè)序列“轉(zhuǎn)變”成內(nèi)側(cè)序列?，F(xiàn)在是66頁\一共有103頁\編輯于星期六(2)盒式PCR盒式PCR（CassettePCR）是利用Cassette(人工合成的帶有適當限制性內(nèi)切酶粘末端較長的雙鏈DNA分子)和Cassette上的引物，特異性擴增目的基因組DNA未知區(qū)域的一種有效的方法。

現(xiàn)在是67頁\一共有103頁\編輯于星期六原理首先用適當?shù)脑谝阎狣NA區(qū)沒有識別位點的酶切割，產(chǎn)生含上下游未知區(qū)域DNA分子，然后與含有對應限制酶切位點的Cassette進行連接，接著用Cassette引物1（C1）和根據(jù)已知區(qū)域設計的特異引物1（S1）進行第一次擴增，最后用Cassette引物2（C1）和根據(jù)已知區(qū)域設計的特異引物2（S2）進行第二次擴增。在設計上Cassette的5`端為-OH，所以目的DNA的3`末`端和Cassette的5`末端連接部位形成缺口。因此第一次PCR反應從引物C1開始延伸反應在連接部位終止，控制了非特異性擴增。只有從引物S1延伸合成的DNA鏈，才能成為引物C1的模板，進行擴增反應。再用內(nèi)側(cè)引物（C2，S2）進一步進行巢式PCR，高效特異地擴增目的DNA未知區(qū)域?，F(xiàn)在是68頁\一共有103頁\編輯于星期六(3)RACE技術RACE（RapidAmplificationofcDNAends）是一種通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術，是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈后用PCR技術擴增出某個特異位點到3`或5`之間的未知序列的方法,分別稱為3`-RACE或5`-RACE。錨定(AnchoredPCR)和反向PCR都可以用于RACE技術，經(jīng)典RACE就是基于錨定PCR技術原理設計的，而高特異性的RACE是借助于反向PCR技術。現(xiàn)在是69頁\一共有103頁\編輯于星期六3`-RACE原理

TTTTT-Q1-Q05`AAAAA3`QTTTTTT-Q1-Q0第一鏈cDNAQT第一次擴增GSP1Q0第二次擴增Q1GSP2反轉(zhuǎn)錄圖經(jīng)典3`-RACE現(xiàn)在是70頁\一共有103頁\編輯于星期六5`-RACE原理第一鏈cDNA5`3`

ORF

GSP-RTGSP-RT逆轉(zhuǎn)錄cDNA加尾

第一鏈cDNAGSP-RTAAAA

第一次擴增Q1-TTTTAAAA第二次擴增Q1圖經(jīng)典5`-RACEGSP1GSP2現(xiàn)在是71頁\一共有103頁\編輯于星期六高特異性的5’-RACE原理高特異性的RACE基于反向PCR擴增技術,它利用已知序列內(nèi)部高特異性的嵌套引物進行擴增的原理，故具有較高的特異性。AAAAAA3’已知序列Pi5’端磷酸化特異引物逆轉(zhuǎn)錄AAAAAA3’已知序列RNaseH降解掉mRNAT4RNALigase環(huán)化單鏈cDNAA2A1S1S2PCR1A1、S1PCR2S2、A2現(xiàn)在是72頁\一共有103頁\編輯于星期六三、轉(zhuǎn)座子標簽法轉(zhuǎn)座子是一類可以在同一條染色體不同位點或不同染色體間轉(zhuǎn)移的一段特殊的DNA。原理轉(zhuǎn)座子插入基因失活或突變構建純合突變株基因組文庫轉(zhuǎn)座子為探針篩選出包含目的基因片段的陽性克隆目的基因片段為探針篩選野生型的植株構建的基因組文庫測序現(xiàn)在是73頁\一共有103頁\編輯于星期六目的基因標簽法×

轉(zhuǎn)座子導入(含轉(zhuǎn)座子的顯性純合體)AA*（隱性純合體）aa

(顯性表型)Aa

（突變或隱性表型）A*a自交aaA*a（突變純合子）A*A*建基因文庫目的基因?qū)娘@性隱性性狀個體都有現(xiàn)在是74頁\一共有103頁\編輯于星期六非目的基因標簽法×

轉(zhuǎn)座子導入(含轉(zhuǎn)座子的顯性純合體)AA*（顯性純合體）AA

（突變或顯性表型）A*A自交AAA*A（突變純合子）A*A*建基因文庫（顯性純合體）AA

關注的是一群因轉(zhuǎn)座子插入引起突變的性狀的基因，目的是篩選于某一性狀相關的幾個基因現(xiàn)在是75頁\一共有103頁\編輯于星期六轉(zhuǎn)座子探針轉(zhuǎn)座子標簽法流程圖

突變純合子基因文庫

轉(zhuǎn)座子目的片段

亞克隆

PCR獲得全長基因篩選

野生型植株基因文庫全長目的基因

現(xiàn)在是76頁\一共有103頁\編輯于星期六四、圖位克隆法圖位克?。焊鶕?jù)目的基因在基因組上的位置特性而不是其編碼產(chǎn)物來進行基因克隆?；蚨ㄎ坏幕静襟E：1、通過DNA連鎖分析、染色體缺失或平衡易位等方法將目的基因或其突變定位到染色體上。2、在目的基因的一側(cè)或兩側(cè)確定一條或兩條緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記，也可以是已知序列基因片段，兩者統(tǒng)稱為DNA分子標記。3、利用緊密連鎖的分子標記序列作探針，通過染色體步移、染色體登陸等技術逐步逼近并最終將目的基因分離出來?，F(xiàn)在是77頁\一共有103頁\編輯于星期六1、染色體步移染色體步移：利用與目的基因緊密連鎖的標記DNA片段為探針篩選基因組文庫，用已獲得的陽性克隆的DNA片段的末端DNA為探針繼續(xù)篩選，如此進行下去，直到獲得含目的基因兩側(cè)序列為止。現(xiàn)在是78頁\一共有103頁\編輯于星期六●●●

篩選

已知的分子標記基因

未知的目的基因350kbYAC基因組文庫分子標記探針篩選

陽性克隆a探針a探針b陽性克隆b重復篩選直到獲得目的基因含目的基因的克隆圖染色體步移篩選目的基因現(xiàn)在是79頁\一共有103頁\編輯于星期六2、染色體登陸如基因組文庫的平均插入片段的長度大于目的基因與已知分子標記的物理距離，就可以通過篩庫直接獲得含目的基因的大片段克隆，接著從中分離出目的基因。這樣就完全避開了步移，這種方法稱為染色體登陸。染色體步移往往因為得不到重疊克隆而被打斷造成前功盡棄或因為基因組的復雜性高而遇到重復序列改變步移方向誤入歧途?，F(xiàn)在是80頁\一共有103頁\編輯于星期六分子標記

Marker

目的基因

Targetgene

100kb探針

基因組文庫

插入DNA≥100kb

陽性克隆進一步證實目的基因圖染色體登陸篩選目的基因現(xiàn)在是81頁\一共有103頁\編輯于星期六第五節(jié)

酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap)90年代，紐約大學的S.Field等建立。現(xiàn)在是82頁\一共有103頁\編輯于星期六有效地分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)二、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個在結(jié)構上可以分開的、功能上也相互獨立的結(jié)構域組成。1.結(jié)構域（Domain）合作一、酵母雙雜交系統(tǒng)的作用現(xiàn)在是83頁\一共有103頁\編輯于星期六例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNAbindingdomainActivedomainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄機GAL4效應基因結(jié)合結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄只要DNAbindingdomain（DNA-BD）與Activedomain（AD）靠近就能夠表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活活性。實驗發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄表達現(xiàn)在是84頁\一共有103頁\編輯于星期六2.拆開

DomainDNAbindingdomainActivedomain上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄機GAL4效應基因結(jié)合用重組DNA技術把GAL4的兩個Domain分開，就喪失了激活效應基因的能力。不能轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在是85頁\一共有103頁\編輯于星期六3.重組Domain用重組DNA技術把這兩個Domain分別與兩個不同的多肽連接。Activedomain蛋白A蛋白BDNAbindingdomain在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結(jié)合。通過效應基因是否被激活來檢查：4.觀察報告基因表達現(xiàn)在是86頁\一共有103頁\編輯于星期六上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄機GAL4效應基因蛋白ADNAbindingdomain轉(zhuǎn)錄激活domain蛋白BGAL4的DBdomain與ADDomain也不能靠近，所以仍然不能啟動效應基因的轉(zhuǎn)錄。不能轉(zhuǎn)錄（1）如果蛋白A與蛋白B不能相互結(jié)合現(xiàn)在是87頁\一共有103頁\編輯于星期六上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄機GAL4效應基因蛋白ADNAbindingdomain轉(zhuǎn)錄激活domain蛋白B激活轉(zhuǎn)錄GAL4的DBdomain與ADDomain也能靠近，所以能啟動效應基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄表達（2）如果蛋白A與蛋白B能相互結(jié)合現(xiàn)在是88頁\一共有103頁\編輯于星期六雙雜交原理X基因和Y基因產(chǎn)物的相互結(jié)合，導致reportergene表達。Reportergene表達就可說明X基因產(chǎn)物于Y基因產(chǎn)物能結(jié)合?，F(xiàn)在是89頁\一共有103頁\編輯于星期六三、構建雙雜交體系的宿主菌

刪除基因組中的內(nèi)源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用載體表達的GAL4蛋白。如：SFY526;HF7c等菌株。四、構建報告基因（reportergene）GAL4激活組氨酸合成酶的表達，使酵母菌能生長在組氨酸缺乏培養(yǎng)基上。GAL4的效應基因是his3/lacZ/URA3。此外還有其他營養(yǎng)缺陷?，F(xiàn)在是90頁\一共有103頁\編輯于星期六1.穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）五、構建雙雜交體系的穿梭質(zhì)粒既能在大腸桿菌中復制，又能在酵母菌中復制和表達的質(zhì)粒。2.雙雜交體系需要兩種穿梭質(zhì)粒分別攜帶已知的靶蛋白基因和攜帶未知基因序列?，F(xiàn)在是91頁\一共有103頁\編輯于星期六靶基因按正確的讀碼結(jié)構和取向克隆在GAL4的BD之后。（1）B