第二講細(xì)胞工程演示文稿

第二講細(xì)胞工程演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有72頁\編輯于星期五優(yōu)選第二講細(xì)胞工程現(xiàn)在是2頁\一共有72頁\編輯于星期五第二節(jié)細(xì)胞的基本概念1.細(xì)胞是生命活動的基本單位細(xì)胞是構(gòu)成有機體的基本單位細(xì)胞是代謝與功能的基本單位：細(xì)胞具有獨立的、有序的自控代謝體系細(xì)胞是有機體生長發(fā)育的基礎(chǔ)：有機體生長是以細(xì)胞增殖與分化為基礎(chǔ)的細(xì)胞具有遺傳的全能性：單個的植物生殖細(xì)胞或單個體細(xì)胞、未受精的兩棲類動物卵細(xì)胞可經(jīng)處理發(fā)育成完整的個體現(xiàn)在是3頁\一共有72頁\編輯于星期五2.細(xì)胞的基本共性所有細(xì)胞表面均有由磷脂雙分子層與鑲嵌蛋白質(zhì)構(gòu)成的生物膜所有細(xì)胞都有兩種核酸：DNA和RNA都有核糖體所有細(xì)胞增殖都以一分為二的方式進行分裂現(xiàn)在是4頁\一共有72頁\編輯于星期五3.細(xì)胞生物學(xué)的研究方法3.1細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡的分辨率受到介質(zhì)折射率和光波長的影響普通光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一現(xiàn)在是5頁\一共有72頁\編輯于星期五激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細(xì)胞形態(tài)的測量，其原理是利用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，由于激光束的波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡現(xiàn)在是6頁\一共有72頁\編輯于星期五3.2.2電子顯微鏡電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，用電磁場作透鏡。另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機制作。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達近百萬倍、由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成，圖現(xiàn)在是7頁\一共有72頁\編輯于星期五3.2.2.1制片技術(shù)1）超薄切片通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差，圖2）負(fù)染技術(shù)負(fù)染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達1.5nm左右，圖

現(xiàn)在是8頁\一共有72頁\編輯于星期五3）冰凍蝕刻

冰凍蝕刻又稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，進行冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻。蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)，圖現(xiàn)在是9頁\一共有72頁\編輯于星期五3.2.3掃描電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。其原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號，圖現(xiàn)在是10頁\一共有72頁\編輯于星期五3.2.4掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡由Binnig等1981年發(fā)明，根據(jù)量子力學(xué)原理中的隧道效應(yīng)而設(shè)計。當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓，針尖與樣品之間產(chǎn)生隧道效應(yīng)而有電子逸出，形成隧道電流。電流強度和針尖與樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，當(dāng)探針沿物質(zhì)表面按給定高度掃描時，因樣品表面原子凹凸不平，使探針與物質(zhì)表面間的距離不斷發(fā)生改變，從而引起電流不斷發(fā)生改變。將電流的這種改變圖像化即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。掃描隧道顯微鏡的分辨率很高，橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.001nm?，F(xiàn)在是11頁\一共有72頁\編輯于星期五3.2.5顯微操作技術(shù)顯微操作技術(shù)是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器進行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機械裝置，圖

現(xiàn)在是12頁\一共有72頁\編輯于星期五4.細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)4.1細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜具有極性頭部和非極性尾部的磷脂分子；蛋白分子以不同的方式鑲嵌在脂雙分子中或結(jié)合在其表面細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)

現(xiàn)在是13頁\一共有72頁\編輯于星期五4.2細(xì)胞器核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)都是在核糖體上合成的，并起始于細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是除核酸外的一系列重要的生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類和糖類合成的基地蛋白質(zhì)的修飾與加工、新生多肽的折疊與組裝都是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行的高爾基體高爾基體主要是將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的多種蛋白進行加工、分類與包裝，然后分別運送到細(xì)胞的特定部位或分泌到細(xì)胞外現(xiàn)在是14頁\一共有72頁\編輯于星期五葉綠體原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的比較現(xiàn)在是15頁\一共有72頁\編輯于星期五5.細(xì)胞工程的基本操作5.1無菌操作技術(shù)細(xì)胞工程的所有試驗都要求在無菌條件下進行，圖5.2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)首先要取材除菌，然后根據(jù)不同細(xì)胞的特點配制培養(yǎng)基并對其進行滅菌處理，最后接種培養(yǎng)5.3細(xì)胞融合技術(shù)兩個或多個細(xì)胞互相接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、遺傳物質(zhì)重組的過程現(xiàn)在是16頁\一共有72頁\編輯于星期五6植物細(xì)胞工程6.1植物組織的培養(yǎng)6.1.1預(yù)備階段選擇合適的外植體外植體只能被誘發(fā)產(chǎn)生無性增殖系的器官或組織切段去除病原菌及雜菌配制適宜的培養(yǎng)基現(xiàn)在是17頁\一共有72頁\編輯于星期五6.1.2誘導(dǎo)去分化階段使植物去分化的主要方法是通過在培養(yǎng)基中添加較高濃度的生長素類激素使植物重新處于旺盛的有絲分裂狀態(tài)6.1.3繼代增殖階段6.1.4生根發(fā)芽階段移栽成活階段植物組織培養(yǎng)過程轉(zhuǎn)基因植物培育過程現(xiàn)在是18頁\一共有72頁\編輯于星期五6.2植物細(xì)胞原生質(zhì)體的制備與融合原生質(zhì)體的制備植物細(xì)胞原生質(zhì)體是指那些已去除全部細(xì)胞壁的細(xì)胞原生質(zhì)體的制備包括取材與除菌、酶解、分離、鑒定5個步驟原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體融合通常采用化學(xué)法誘導(dǎo)融合、物理法誘導(dǎo)融合6.2.3雜合體的鑒別與篩選現(xiàn)在是19頁\一共有72頁\編輯于星期五7動物細(xì)胞的培養(yǎng)7.1細(xì)胞培養(yǎng)法動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法通常是，圖絕大多數(shù)哺乳動物的細(xì)胞趨向于貼壁生長，且細(xì)胞具有接觸抑制作用，因此培養(yǎng)大量細(xì)胞時需要較大的支持面，其中的方法有微導(dǎo)管培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法、微膠囊培養(yǎng)法7.2組織培養(yǎng)法動物細(xì)胞培養(yǎng)常用儀器現(xiàn)在是20頁\一共有72頁\編輯于星期五7.3淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體技術(shù)7.3.1抗原抗體反應(yīng)當(dāng)某些外源生物（細(xì)菌等）或生物大分子（蛋白質(zhì)），即抗原，進入動物體內(nèi)后會刺激后者產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，引起免疫應(yīng)答，從而將前者清除或分解哺乳動物主要有兩類淋巴細(xì)胞：T細(xì)胞和B細(xì)胞，后者可以分泌抗體。由于環(huán)境復(fù)雜，大量抗原誘使B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量抗體，所以如果想獲得大量專一性抗體就要從某個特定B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)出大量的細(xì)胞群體，即克隆。由于其遺傳的高度一致性，由它們分泌的抗體稱為單克隆抗體現(xiàn)在是21頁\一共有72頁\編輯于星期五B淋巴細(xì)胞不能在體外無限的分裂，所以抗體的產(chǎn)生受到很大的限制，但是腫瘤細(xì)胞可以無限增殖，因此科學(xué)家想到將兩者進行細(xì)胞融合從而產(chǎn)生大量抗體單克隆抗體基本原理7.4其他的與細(xì)胞有關(guān)的生命體病毒（多發(fā)性黏液瘤病毒、流感病毒）類病毒朊病毒現(xiàn)在是22頁\一共有72頁\編輯于星期五8干細(xì)胞技術(shù)8.1干細(xì)胞的定義及分類干細(xì)胞（未分化細(xì)胞)：具有自我更新和分化發(fā)育潛能的原始細(xì)胞干細(xì)胞能在未分化狀態(tài)下通過細(xì)胞分裂的方式進行長期繁殖延續(xù)；在特定生理條件下能誘導(dǎo)分化成具有特定功能的分化細(xì)胞干細(xì)胞分為：胚胎干細(xì)胞（多能干細(xì)胞）組織干細(xì)胞（專能干細(xì)胞）現(xiàn)在是23頁\一共有72頁\編輯于星期五8.2造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞的特點造血干細(xì)胞具有高度的自我更新能力能力；它可以分化生成所有類型的血細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞和血小板）造血干細(xì)胞的分化過程造血干細(xì)胞的分裂方式為不對稱分裂，分裂后，其中一個保持造血干細(xì)胞的一切特征，另一個則分化為早期的造血祖細(xì)胞現(xiàn)在是24頁\一共有72頁\編輯于星期五造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用造血干細(xì)胞的移植造血干細(xì)胞與基因治療選擇造血干細(xì)胞作為靶細(xì)胞8.2.5造血干細(xì)胞的可塑性造血干細(xì)胞不但可以分化成血細(xì)胞，在不同的環(huán)境中，由于受到相應(yīng)的細(xì)胞分化信號調(diào)節(jié)，其還可以分化為肌肉細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等現(xiàn)在是25頁\一共有72頁\編輯于星期五9胚胎干細(xì)胞9.1胚胎干細(xì)胞的起源胚胎干細(xì)胞由“囊胚腔”內(nèi)一側(cè)的細(xì)胞群發(fā)育而成9.2胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞可以來自捐獻，也可以從5～9周流產(chǎn)的胎兒體內(nèi)提取9.3胚胎干細(xì)胞早期應(yīng)用動物克隆胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用（人體細(xì)胞培養(yǎng)）現(xiàn)在是26頁\一共有72頁\編輯于星期五10癌細(xì)胞10.1癌細(xì)胞的主要特征癌細(xì)胞有三個顯著的基本特征即：不死性，遷移性和失去接觸抑制癌細(xì)胞的不死性腫瘤組織的細(xì)胞周期失控，不受正常生長調(diào)控系統(tǒng)的控制，能持續(xù)的分裂與增殖代謝旺盛，DNA和RNA聚合酶活性均高于正常組織，核酸分解過程明顯降低，DNA和RNA的含量均明顯增高蛋白質(zhì)合成及分解代謝都增強，但合成代謝超過分解代謝，甚至可奪取正常組織的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，結(jié)果可使機體處于嚴(yán)重消耗的惡病質(zhì)（cachexia）狀態(tài)?，F(xiàn)在是27頁\一共有72頁\編輯于星期五10.1.2癌細(xì)胞的遷移性細(xì)胞粘著和連接相關(guān)的成分發(fā)生變異或缺失，細(xì)胞失去與細(xì)胞間和細(xì)胞外基質(zhì)間的聯(lián)結(jié)，易于從腫瘤上脫落。許多癌細(xì)胞具有變形運動能力，并且能產(chǎn)生酶類，使血管基底層和結(jié)締組織穿孔，使它向其它組織遷移（圖）接觸抑制喪失正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時表現(xiàn)為貼壁生長和匯合成單層后停止生長的特點，即接觸抑制現(xiàn)象，而腫瘤細(xì)胞即使堆積成群，仍然可以生長（圖）現(xiàn)在是28頁\一共有72頁\編輯于星期五10.2癌細(xì)胞形成的原因10.2.1癌細(xì)胞形成的內(nèi)因腫瘤的形成與原癌基因和抑癌基因的突變有關(guān)原癌基因原癌基因(oncogene)是細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，是維持機體正常生命活動所必須的。當(dāng)原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強時，使細(xì)胞過度增殖，從而形成腫瘤現(xiàn)在是29頁\一共有72頁\編輯于星期五10.2.1.2抑癌基因抑癌基因也稱為抗癌基因，其產(chǎn)物是抑制細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞分化和抑制細(xì)胞遷移，抑癌基因的突變是隱性的散發(fā)性和遺傳性Rb功能喪失的機理，圖10.2.1.3原癌基因的激活原癌基因的激活方式多種多樣，概括起來有：基因本身或其調(diào)控區(qū)發(fā)生了變異，導(dǎo)致基因的過表達，或產(chǎn)物蛋白活性增強，使細(xì)胞過度增殖，形成腫瘤，圖現(xiàn)在是30頁\一共有72頁\編輯于星期五腫瘤形成的外因化學(xué)致癌物生物因素物理致癌現(xiàn)在是31頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是32頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是33頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是34頁\一共有72頁\編輯于星期五普通光學(xué)顯微鏡現(xiàn)在是35頁\一共有72頁\編輯于星期五熒光顯微鏡及其觀察效果（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）現(xiàn)在是36頁\一共有72頁\編輯于星期五激光共聚焦掃描顯微鏡（藍色為細(xì)胞核，綠色為微管）現(xiàn)在是37頁\一共有72頁\編輯于星期五微分干涉差顯微鏡效果（硅藻）現(xiàn)在是38頁\一共有72頁\編輯于星期五電子顯微鏡和超薄切片機現(xiàn)在是39頁\一共有72頁\編輯于星期五內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色）現(xiàn)在是40頁\一共有72頁\編輯于星期五肌動蛋白纖維的負(fù)染電鏡照片現(xiàn)在是41頁\一共有72頁\編輯于星期五冰凍蝕刻電鏡照片現(xiàn)在是42頁\一共有72頁\編輯于星期五掃描電鏡和類血細(xì)胞照片現(xiàn)在是43頁\一共有72頁\編輯于星期五尼康NT-88NE顯微操作/注射儀現(xiàn)在是44頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是45頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是46頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是47頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是48頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是49頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是50頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是51頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是52頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是53頁\一共有72頁\編輯于星期五現(xiàn)在是54