微生物檢驗(yàn)流程與質(zhì)量控制

主要內(nèi)容常見標(biāo)本的檢驗(yàn)流程血培養(yǎng)（無菌體液培養(yǎng)）痰培養(yǎng)（以及其他呼吸系統(tǒng)標(biāo)本）尿培養(yǎng)糞便培養(yǎng)質(zhì)量控制人員能力試劑與儀器（包括儀器校準(zhǔn)、各項(xiàng)鑒定試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控）環(huán)節(jié)控制（全程質(zhì)控）首代分離培養(yǎng)基質(zhì)量控制第一頁，共64頁。常見標(biāo)本的檢驗(yàn)流程第二頁，共64頁。血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程樣本接收推片法制片染色鏡檢血培養(yǎng)儀增菌陽性培養(yǎng)液涂片一級(jí)報(bào)告首代培養(yǎng)目標(biāo)菌落選取鑒定藥敏綜合報(bào)告第三頁，共64頁。痰培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程樣本接收痰液洗滌壓片法制片染色鏡檢肉眼篩選分類鏡下篩選痰液消化痰液接種首代培養(yǎng)目標(biāo)菌落選取鑒定藥敏綜合報(bào)告第四頁，共64頁。尿培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程樣本接收沉渣涂片離心鏡下篩選染色鏡檢首代培養(yǎng)（菌落計(jì)數(shù)）目標(biāo)菌落選取鑒定藥敏綜合報(bào)告第五頁，共64頁。糞便培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程樣本接收鏡下篩選（糞便常規(guī)）壓片法制片染色鏡檢選擇性增菌培養(yǎng)首代培養(yǎng)目標(biāo)菌落選取鑒定藥敏綜合報(bào)告第六頁，共64頁。其他標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)化操作流程《實(shí)用臨床微生物檢驗(yàn)與圖譜》衛(wèi)生部規(guī)范化操作流程圖第七頁，共64頁。質(zhì)量控制第八頁，共64頁。概念狹義質(zhì)量控制：對(duì)試劑和儀器的控制廣義質(zhì)量控制：對(duì)所有影響試驗(yàn)結(jié)果可靠性的因素進(jìn)行的全面質(zhì)量控制試驗(yàn)人員技術(shù)能力的控制——操作的標(biāo)準(zhǔn)化與試驗(yàn)結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)化試劑的保存與正確使用儀器的正確使用、定期維護(hù)與校準(zhǔn)鑒定試劑陰陽性結(jié)果的典型性與試劑的穩(wěn)定性考察藥敏試驗(yàn)（紙片、MIC板卡、E-test試條、MH培養(yǎng)基等）的室內(nèi)質(zhì)控嚴(yán)格但合理的首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施流程中不同環(huán)節(jié)試驗(yàn)之間的相互印證第九頁，共64頁。質(zhì)量控制中的重點(diǎn)人員能力的培訓(xùn)、考核與權(quán)限的授予流程中不同環(huán)節(jié)試驗(yàn)之間的相互印證首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施藥敏試驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制第十頁，共64頁。人員能力的

培訓(xùn)、考核與權(quán)限的授予在所有影響因素中，人的因素居于首位臨床微生物檢驗(yàn)是一個(gè)智力因素占首要地位的行業(yè)，是真正意義上的診斷學(xué)。在歐美從屬于臨床病理的范疇基礎(chǔ)知識(shí)的扎實(shí)程度、臨場實(shí)踐能力的高低、自主學(xué)習(xí)能力的強(qiáng)弱直接影響工作質(zhì)量的好壞個(gè)人能力在報(bào)告質(zhì)量中有直接而明顯的體現(xiàn)第十一頁，共64頁。人員能力的

培訓(xùn)、考核與權(quán)限的授予在微生物室對(duì)后進(jìn)人員的培訓(xùn)考核是一項(xiàng)長期任務(wù)，對(duì)于人才梯隊(duì)的形成和特殊能力的傳承有著重要意義根據(jù)每個(gè)人員能力的層次分別授予對(duì)應(yīng)等級(jí)的權(quán)限對(duì)于控制微生物室整體質(zhì)量，防范錯(cuò)誤的發(fā)生，提高報(bào)告質(zhì)量有確定的意義第十二頁，共64頁。流程中不同環(huán)節(jié)試驗(yàn)

之間的相互印證建立全程質(zhì)控的觀點(diǎn)對(duì)于提高微生物檢驗(yàn)質(zhì)量意義重大通過不同環(huán)節(jié)試驗(yàn)結(jié)果之間的推衍和反證可及時(shí)發(fā)現(xiàn)一些錯(cuò)誤的存在，并及時(shí)進(jìn)行糾正可防止錯(cuò)誤報(bào)告的發(fā)出不同環(huán)節(jié)之間的推衍與反證可讓我們發(fā)現(xiàn)平時(shí)質(zhì)控中難以發(fā)現(xiàn)的失控現(xiàn)象，便于我們制訂相應(yīng)的規(guī)則堵住漏洞，對(duì)于工作的持續(xù)改進(jìn)有著重要的意義第十三頁，共64頁。首代分離培養(yǎng)基質(zhì)控措施目前國內(nèi)有超過10家商品成品培養(yǎng)基制造商，由于生產(chǎn)工藝簡單，技術(shù)壁壘較低，有無研發(fā)實(shí)力的公司都來趟這趟渾水，導(dǎo)致成品培養(yǎng)基市場非?；靵y，質(zhì)量良莠不齊首代分離培養(yǎng)基是制約微生物檢驗(yàn)陽性率的門戶，分離到細(xì)菌是一切成功檢驗(yàn)的前提條件。其質(zhì)量的好壞直接影響微生物檢驗(yàn)的整體質(zhì)量。在“檢驗(yàn)中”階段，所有影響因素中，該因素所占的比重最大第十四頁，共64頁。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控過程控制結(jié)果控制第十五頁，共64頁。藥敏試驗(yàn)過程控制第十六頁，共64頁。擴(kuò)散法第十七頁，共64頁。試驗(yàn)方法與條件CLSI推薦培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)要求細(xì)菌使用水解酪蛋白瓊脂（MHA）平板肺鏈?zhǔn)褂煤?%綿羊血的含血MHA嗜血桿菌使用HTM培養(yǎng)基淋球菌使用含1%生長因子（不含L-半胱氨酸）補(bǔ)充劑的GC培養(yǎng)基平皿大?。鹤钚?0mm，通常使用150mm平板瓊脂厚度4±1mm菌液濃度0.5McF（約1.5×108CFU/ml）第十八頁，共64頁。涂布方法：無菌棉簽浸透菌液后稍微擠干，棉簽與平板呈30°左右的傾角密集左右來回涂布，完成一遍后旋轉(zhuǎn)120°后再涂，如此三次，最后繞邊緣一次紙片之間最佳間距30mm，不得低于25mm培養(yǎng)溫度；35℃；重疊時(shí)不超過3個(gè)碟子氣體環(huán)境：普通細(xì)菌大氣環(huán)境；嗜血桿菌、淋球菌、肺鏈置CO2環(huán)境培養(yǎng)時(shí)間：18小時(shí)第十九頁，共64頁。測量方法透射光葡萄球菌利奈唑胺苯唑西林萬古霉素腸球菌萬古霉素第二十頁，共64頁。反射光測量其他細(xì)菌與藥物時(shí)第二十一頁，共64頁。變形桿菌忽略環(huán)內(nèi)的遷徙生長第二十二頁，共64頁。測量肉眼可見的明顯抑菌區(qū)忽略環(huán)邊緣的微弱生長第二十三頁，共64頁。環(huán)內(nèi)生長現(xiàn)象大腸藥敏，被腸球菌污染銅綠假單胞菌耐藥亞群第二十四頁，共64頁。特殊處理方法當(dāng)受測抑菌環(huán)與旁邊的融合時(shí)，選擇完整部分測量當(dāng)受測抑菌環(huán)部分變形時(shí)，選擇正常部分測量第二十五頁，共64頁。擴(kuò)散法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值營養(yǎng)程度（腸球菌能生長）厚度抗生素拮抗劑含量（用29212監(jiān)控）鈣鎂離子含量、鋅離子含量（用27853氨基糖苷類和亞胺配能結(jié)果監(jiān)控）菌懸液濃度高抑菌環(huán)縮小濃度低則擴(kuò)大細(xì)菌純度氣體環(huán)境普通細(xì)菌放CO2時(shí)由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥苛養(yǎng)菌放普通環(huán)境生長不良，導(dǎo)致假敏感培養(yǎng)時(shí)間粘液性銅綠需48小時(shí)測量方法第二十六頁，共64頁。稀釋法第二十七頁，共64頁。試驗(yàn)方法與條件CLSI推薦培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)要求細(xì)菌使用補(bǔ)充陽離子MH肉湯肺鏈?zhǔn)褂煤?%凍融馬血的MH肉湯嗜血桿菌使用HTM肉湯厭氧菌和微需氧菌使用布氏肉湯淋病奈瑟菌推薦強(qiáng)化GC作瓊脂稀釋法菌液濃度（5×104CFU/ml）：初始菌液0.5McF（約1.5×108CFU/ml）鹽水稀釋200倍，加入0.1ml菌液到含有0.1ml雙倍濃縮的MH肉湯的微孔板中（或預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)濃度的MH肉湯稀釋后再加到微孔中）第二十八頁，共64頁。接種后應(yīng)充分混勻，但不能有氣泡產(chǎn)生靜置培養(yǎng)培養(yǎng)溫度；35℃氣體環(huán)境：所有細(xì)菌（包括苛養(yǎng)菌）均置大氣環(huán)境；厭氧菌置厭氧環(huán)境；微需氧菌置微需氧環(huán)境；淋菌瓊脂稀釋法置CO2培養(yǎng)時(shí)間：18小時(shí)結(jié)果讀?。阂姾竺娴幕脽簦旱诙彭摚?4頁。常量稀釋法藥敏試驗(yàn)的參考方法：

將標(biāo)準(zhǔn)接種物加入含対倍稀釋抗生素的MH肉湯管中.過夜培養(yǎng).MIC即是能抑制細(xì)菌生長的含最低抗生素的濃度的那一管所標(biāo)示的濃度值.104cfu/ml4210.50.250.120mg/ml第三十頁，共64頁。微量肉湯稀釋法第三十一頁，共64頁。微量肉湯稀釋法

結(jié)果讀取技巧磺胺類藥物容易出現(xiàn)弱生長，只要滿足70%以上抑菌率即可視為未生長真菌藥敏三唑類藥物容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象（即低濃度孔易出現(xiàn)弱生長），判讀時(shí)以對(duì)照孔為參照，＞80%的抑菌率即可視為未生長大于三孔不同梯度濃度的抗生素測試中，出現(xiàn)的高濃度生長，而低濃度不生長現(xiàn)象叫跳孔。造成跳孔的主要原因，菌懸液乳化不充分，細(xì)菌分散不足，以及藥敏卡某些孔被污染跳孔的解決方法：根據(jù)其他藥理學(xué)特征類似的抗生素的敏感性以及分析其他同類不同種抗生素的敏感性進(jìn)行推斷性修正修正低濃度——耐藥修正高濃度——敏感第三十二頁，共64頁。肉湯稀釋法注意事項(xiàng)生長緩慢微生物（形成肉眼可見生長＞1周）不適合用MIC法在肉湯中發(fā)育不良的微生物不適合用MIC粘液性銅綠假單胞菌——只能用擴(kuò)散法，48小時(shí)觀察結(jié)果淋病奈瑟菌——CLSI無肉湯稀釋法藥敏指南注意微弱生長導(dǎo)致的假敏感（結(jié)果需要修正）例如銅綠對(duì)磺胺、四環(huán)素、頭孢噻肟/曲松鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨曲南肺克、陰溝、變形桿菌對(duì)呋喃妥因第三十三頁，共64頁。稀釋法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值營養(yǎng)程度抗生素拮抗劑含量鈣鎂離子含量（鈣10-25；鎂10-12.5μg/ml）菌懸液（5×104CFU/ml）接種效應(yīng)濃度高M(jìn)IC抬高濃度低MIC壓低細(xì)菌純度氣體環(huán)境所有需氧細(xì)菌均放普通大氣環(huán)境。如果放CO2，由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥培養(yǎng)時(shí)間真菌需48小時(shí)奴卡菌需5天第三十四頁，共64頁。E-test法第三十五頁，共64頁。MIC值標(biāo)注于試條的光面Etest試條毛面貼于MHA上第三十六頁，共64頁。Etest操作程序按照擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)操作涂布接種貼上試條并培養(yǎng)15-18小時(shí)讀取抑菌濃度并按標(biāo)準(zhǔn)解釋第三十七頁，共64頁。

肺炎鏈球菌

青霉素MIC=3g/ml結(jié)果讀取第三十八頁，共64頁。第三十九頁，共64頁。藥敏試驗(yàn)結(jié)果控制第四十頁，共64頁。藥敏試驗(yàn)結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)CLSI標(biāo)準(zhǔn)；全球性每年更新非強(qiáng)制性學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)FDA標(biāo)準(zhǔn)（全球標(biāo)準(zhǔn)）建立在CLSI基礎(chǔ)上6~8年更新一次官方機(jī)構(gòu)，標(biāo)準(zhǔn)帶有強(qiáng)制性法國CASFM標(biāo)準(zhǔn)；

梅里埃產(chǎn)品習(xí)慣采用的CLSI以外的標(biāo)準(zhǔn)英國BSAC標(biāo)準(zhǔn)；歐洲應(yīng)用比較廣泛的標(biāo)準(zhǔn)歐洲EUCAST標(biāo)準(zhǔn)……..第四十一頁，共64頁。CLSI藥敏解釋標(biāo)準(zhǔn)CLSI(ClinicalLaboratorystandardinstitution)藥敏指南

CLSI第四十二頁，共64頁。CLSI藥敏文件M100-S22常見菌(2012)**M11-A7

厭氧菌(2007)M39-A3

積累抗菌譜(2009)M24-A

分枝桿菌,奴卡菌,以及其他需氧放線菌M27-A2酵母樣真菌MIC法(2002)M44-A

真菌紙片擴(kuò)散法(2004)M45-A低頻分離菌與苛養(yǎng)菌(2006)* M100updatedyearly第四十三頁，共64頁。CLSIM100-S22解釋標(biāo)準(zhǔn)

覆蓋的細(xì)菌類別腸桿菌科銅綠假單胞菌不動(dòng)桿菌屬洋蔥伯克霍爾德菌嗜麥芽窄食單胞菌其他非腸道桿菌葡萄球菌屬腸球菌屬流感嗜血桿菌與副流感桿菌淋病奈瑟菌肺炎鏈球菌Β-溶血鏈球菌草綠色鏈球菌腦膜炎奈瑟菌厭氧菌第四十四頁，共64頁。不同細(xì)菌適用的藥敏方法部分細(xì)菌同時(shí)具有擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)和MIC標(biāo)準(zhǔn)，但具有擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)的藥物相對(duì)較少部分細(xì)菌（某些藥物）只有MIC標(biāo)準(zhǔn)其他非腸道細(xì)菌所有藥物葡萄球菌萬古霉素、托達(dá)霉素腸球菌托達(dá)霉素肺鏈除苯唑西林以外的其他β內(nèi)酰胺類Β溶血鏈球菌除青霉素、氨芐青霉素、頭孢吡肟、噻肟、曲松外的其他β內(nèi)酰胺類草綠色鏈球菌除頭孢吡肟、噻肟、曲松外的其他β內(nèi)酰胺類厭氧菌所有藥物淋菌只有擴(kuò)散法和瓊脂稀釋法，無肉湯稀釋法標(biāo)準(zhǔn)第四十五頁，共64頁。少見菌和苛養(yǎng)菌的特殊藥敏參考方法：M45-A乏養(yǎng)菌與顆粒鏈菌——稀釋法嗜水氣單胞菌復(fù)合群——稀釋法與擴(kuò)散法弧菌屬細(xì)菌（霍亂除外）——稀釋法與擴(kuò)散法芽孢桿菌屬（炭疽除外）——稀釋法空腸/大腸彎曲菌——稀釋法與擴(kuò)散法棒狀桿菌——稀釋法（可用的藥物標(biāo)準(zhǔn)比BSAC標(biāo)準(zhǔn)提供的多）MethodsforAntimicrobialDilutionandDiskSusceptibilityTestingofInfrequentlyIsolatedorFastidiousBacteria；Approvedguideline第四十六頁，共64頁。豬紅斑丹毒似菌——稀釋法HACEK組苛養(yǎng)性G-桿菌——稀釋法卡他莫拉菌——稀釋法產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌——稀釋法巴斯德菌——稀釋法其他，如乳桿菌、片球菌、無色藻菌——稀釋法第四十七頁，共64頁。分枝桿菌,奴卡菌,以及

其他需氧放線菌藥敏參考方法：M24-A結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群——比例法緩慢生長非結(jié)核分枝桿菌——稀釋法快速生長分枝桿菌——稀釋法奴卡菌等需氧放線菌——稀釋法SusceptibilityTestingofMycobacteria,Nocardiae,andOtherAerobicActinomycetes;ApprovedStandard第四十八頁，共64頁。真菌藥敏M27-A2用于酵母樣真菌的稀釋法藥敏——只有氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶有解釋標(biāo)準(zhǔn)，其他藥物的測試結(jié)果報(bào)告MICM44-A用于酵母樣真菌的擴(kuò)散法藥敏——只有氟康唑有解釋標(biāo)準(zhǔn)M38-P用于絲狀真菌的稀釋法藥敏——只有操作方法，報(bào)告MIC值，但無解釋標(biāo)準(zhǔn)第四十九頁，共64頁。藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制要點(diǎn)意義：保障藥敏結(jié)果的可靠性——準(zhǔn)確性和精密度控制環(huán)節(jié)要點(diǎn)（重要的五大環(huán)節(jié)）：*質(zhì)控1：人員操作能力質(zhì)控2：菌液濃度（比濁）質(zhì)控3：培養(yǎng)基質(zhì)量質(zhì)控4：藥敏試劑（紙片或MIC試卡/板）、讀取藥敏結(jié)果的儀器設(shè)備*質(zhì)控5：異常結(jié)果的發(fā)現(xiàn)與修正參照指南：CLSI文件第五十頁，共64頁。*質(zhì)控1：人員標(biāo)準(zhǔn)操作指南：擴(kuò)散法參照CLSI-M2文件；MIC法參照M7文件考核內(nèi)容：基本操作步驟的熟練程度結(jié)果的正確讀取第五十一頁，共64頁。人員：操作步驟的熟練程度按照標(biāo)準(zhǔn)程序操作，能在15分鐘內(nèi)完成單個(gè)分離菌的藥敏試驗(yàn)操作操作過程：菌落的挑取手法菌液的配制操作與菌液混勻操作擴(kuò)散法中菌液涂布操作MIC法中菌液的稀釋操作儀器法中儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作手法菌懸液純度和濁度的驗(yàn)證性操作；第五十二頁，共64頁。人員：結(jié)果的正確讀取抑菌環(huán)的正確測量——忽略邊緣的微弱生長環(huán)內(nèi)生長的檢測——污染菌的發(fā)現(xiàn)或耐藥亞群的分離確認(rèn)MIC值的正確讀取包括跳孔現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與糾正微弱生長孔的發(fā)現(xiàn)與結(jié)果修正（磺胺、四環(huán)、氯霉素、氨曲南…）拖尾現(xiàn)象的正確忽略（磺胺、真菌）生長不良的確認(rèn)與補(bǔ)救措施（重做、延長）第五十三頁，共64頁。質(zhì)控2：菌液濁度控制目測法控制內(nèi)容：主要是0.5McF濁度的感知能力參照物：0.5McF硫酸鋇比濁管，對(duì)應(yīng)1.5×108CFU/ml參考方法：菌液稀釋后菌落計(jì)數(shù)法允許誤差：1.5×107~1.5×109CFU/ml儀器法控制內(nèi)容：同上校準(zhǔn)品：0.5~4McF硫酸鋇比濁管參考方法：同上允許誤差：同上第五十四頁，共64頁。質(zhì)控3：MH培養(yǎng)基質(zhì)量控制pH值營養(yǎng)程度：不加血的情況下就能支持ATCC29212的生長

抗生素拮抗劑含量：使用ATCC29212監(jiān)測，擴(kuò)散法有抑菌環(huán)出現(xiàn)，并且環(huán)內(nèi)只允許微量小菌落出現(xiàn)；MIC法抑菌率＞80%鈣鎂離子含量：鈣10-25、鎂10-12.5μg/ml鋅離子含量：ATCC27853亞胺配能結(jié)果在允許范圍內(nèi)第五十五頁，共64頁。質(zhì)控4：藥敏試劑質(zhì)控CLSI提供擴(kuò)散法和稀釋法的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)適合于紙片擴(kuò)散法稀釋法標(biāo)準(zhǔn)適合于微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法，以及E-test法內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控頻率各種藥物的控制范圍第五十六頁，共64頁。擴(kuò)散法質(zhì)控菌株非苛養(yǎng)菌：腸桿菌科ATCC25922大腸；非發(fā)酵菌27853銅綠；葡萄球菌25923金葡；加酶抑制劑抗生素質(zhì)控35218產(chǎn)ESBL大腸苛養(yǎng)菌：嗜血桿菌49247流感，49766流感用于補(bǔ)充，彌補(bǔ)49247某些不能檢測的藥物；淋菌用49226；肺鏈用49619第五十七頁，共64頁。擴(kuò)散法控制范圍點(diǎn)擊放大第五十八頁，共64頁。稀釋法質(zhì)控菌株非苛養(yǎng)菌：腸桿菌科25922；葡萄球菌29213；腸球菌29212；非發(fā)酵菌27853；加酶抑制劑抗生素質(zhì)控35218苛養(yǎng)菌：嗜血桿菌49247，49766流感用于補(bǔ)充；淋菌用49226；肺鏈、其他鏈球菌，以及腦膜炎球菌藥敏質(zhì)控用49619；49226用于淋菌瓊脂稀釋法質(zhì)控其他低頻分離菌：根據(jù)相應(yīng)的文件規(guī)定。一般都是選用上述質(zhì)控菌株中的某些第五十九頁，共64頁。稀釋法控制范圍點(diǎn)擊放大第六十頁，共64頁。自動(dòng)化藥敏儀器的質(zhì)控主要是光學(xué)部件讀取數(shù)據(jù)時(shí)的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性——由儀器內(nèi)置自檢部件按規(guī)定時(shí)間間隔自動(dòng)進(jìn)行，如果自檢不能通過，儀器會(huì)報(bào)