分子生物學(xué)第三章下轉(zhuǎn)錄后加工

分子生物學(xué)第三章下轉(zhuǎn)錄后加工第1頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)tRNA和rRNA的加工一.原核的tRNA和rRNA的加工參與蛋白質(zhì)合成的tRNA和rRNA都不是最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(1)它們的5′端都是單磷酸，而原始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′應(yīng)是三磷酸；(2)分子比初始轉(zhuǎn)錄物?。?3)tRNA含有特殊的堿基，這些堿基只有通過一些化學(xué)修飾才可以得到。第2頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四表13-1E.coli中含有的小分子核酸酶 酶 基因 底物 功能 RNaseP rnpA tRNA5′端 內(nèi)切 RnaseO rnpB

RnaseBN ? tRNA3′端 外切 RnaseD rnd tRNA3′端 外切 RnaseT ? tRNA3′CCA 外切 RnaseⅢrnc rRNA和mRNA 內(nèi)切 RnaseR ? rRNA和mRNA 外切 RnaseE rne 5SrRNA 內(nèi)切 RnaseⅠrna 大部分RNA 內(nèi)切 RnaseⅡ rnb RNA 外切 多核苷酸磷酸化酶pnp RNA外切 RnaseHrnh RNA-DNA雜合鏈內(nèi)切

《GENES》IV，1990.B.Lewin,Table14.2第3頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四(一)tRNA的加工tRNA的加工分成3個(gè)階段(1)“斬頭”，形成5′末端；(2)去尾，形成3′-OH末端。缺-CCA的

tRNA要用tRNA核酸轉(zhuǎn)移酶加-CCA。(3)修飾：通過甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等進(jìn)行修飾，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鳥苷（2mG），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密碼子環(huán)上的2異戊腺苷（2ipA) 第4頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四MaturetRNA第5頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第6頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第7頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四真核tRNA內(nèi)含子的特點(diǎn)：①位置相同，都在反密碼子環(huán)的下游；②不同tRNA的內(nèi)含子長(zhǎng)度和序列各異；③外顯子和內(nèi)含子交界處無保守序列；④內(nèi)含子的剪切是依靠RNase異體催化；⑤內(nèi)含子和反密碼子配對(duì)形成莖環(huán)。

第8頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第9頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

二真核的tRNA和rRNA的加工真核tRNA的基因和原核不同：(1)真核的前體分子tRNA是單順反子，但成簇排列，基因間有間隔區(qū)；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母約有400個(gè)tRNA基因；(3)5′端單磷酸核苷酸，表明已被加工過；(4)tRNA的前體分子中含有內(nèi)含子。第10頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四真核tRNA內(nèi)含子切除的特點(diǎn)：(1)沒有交界序列，也沒有內(nèi)部引導(dǎo)序列；(2)剪切反應(yīng)的信號(hào)是二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不是一級(jí)結(jié)構(gòu)；(3)是依賴于蛋白質(zhì)性的RNase，而不是核糖擬酶或snRNP；(4)反應(yīng)的本質(zhì)不是轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。第11頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四酵母tRNA前體內(nèi)含子3’和5’端的剪切是由內(nèi)切酶的不同亞基催化的。亞基Sen34,Sen2剪切3’端和5’端.Sen54可能通過量度成熟結(jié)構(gòu)域的距離來決定5’端剪切位點(diǎn)的位置。A1堿基對(duì)也是重要的。第13頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四古細(xì)菌tRNA用于剪切的核酸內(nèi)切酶在每個(gè)“突起－螺旋－突起”片段的突起處切割每條鏈第14頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

真核tRNA的加工和原核的區(qū)別(1)真核tRNA前體中無二聚體和多聚體；(2)增加了剪接內(nèi)含子的過程；(3)都要加CCA。第16頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四真核細(xì)胞中rRNA的加工途徑(1)切除5′端的前導(dǎo)序列；(2)從41S的中間產(chǎn)物中先切下18S的片段。

Hela細(xì)胞的切點(diǎn)在18S和5.8S之間的ITS（內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列）；L細(xì)胞的切點(diǎn)在18S序列和ITS的交界處，稱為先成熟。(3)部分退火，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；(4)最后修正。第17頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)前體mRNA的加工mRNA前體分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不經(jīng)過加工。真核mRNA的加工一般要經(jīng)過四步：

(1)5′加帽；

(2)3′加尾；

(3)切除內(nèi)含子；

(4)修飾：對(duì)某些堿基進(jìn)行甲基化。第19頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

原核生物mRNA的加工原核生物的mRNA很少經(jīng)過加工，但在少數(shù)情況下多順反mRNA先被內(nèi)切核酸酶切成較小的單位再成為翻譯的模板第20頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第21頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第22頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第23頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四二真核mRNA前體的加工(一)核內(nèi)不均一RNA（heterogenousnuclearRNA,hnRNA）平均分子長(zhǎng)度為8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均長(zhǎng)度（1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA僅有總量的1/2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其余的都在核內(nèi)被降解掉。hnRNA是mRNA的前體，證據(jù)是：

(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；

(2)hnRNA在體外能作為模板翻譯蛋白；

(3)兩者5′端都有帽子結(jié)構(gòu)；

(4)表明二者為相同的聚合酶所合成；

(5)兩者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。第24頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四hnRNA的結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)(1)5′端有帽結(jié)構(gòu)；(2)3′端有poly（A）尾巴；(3)帽結(jié)構(gòu)后有3個(gè)寡聚U區(qū)，每個(gè)長(zhǎng)約30nt；(4)有重復(fù)序列，位于寡聚U區(qū)后面；(5)有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可能分布于編碼區(qū)（非重復(fù)序列）的兩側(cè)；(6)非重復(fù)序列中有內(nèi)含子區(qū)。第25頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第26頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四hnRNA的物理結(jié)構(gòu)是核糖核蛋白顆粒（hnRNP）,顆粒中蛋白質(zhì)包圍著hnRNA。體外研究表明hnRNA的形狀是一個(gè)球體和一個(gè)與之相連的纖維狀結(jié)構(gòu)。第27頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四在細(xì)胞核中，RNA加工包括3‘端和5’端修飾以及內(nèi)含子的去除等。剪切需要在內(nèi)含子與外顯子交界處產(chǎn)生斷裂，然后將外顯子末端連接。成熟的mRNA通過核孔被運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在那里它完成翻譯。第28頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四1．加帽(1)剪接前加帽如呼腸病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽如皰疹病毒和口炎病毒第29頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四7－甲基鳥苷三磷酸第30頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第31頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四帽子的類型在末端鳥苷的第7位上存在單個(gè)甲基化位點(diǎn)的稱0型帽子（cap0）；在次末端核苷酸的核糖上的2′-o位點(diǎn)上還有一個(gè)甲基位點(diǎn)的稱1型帽子(cap1)；此外，在第三個(gè)核苷酸的核糖上（2′-o）有甲基化位點(diǎn)的稱2型帽子（cap2）。這三種帽子都有特殊面對(duì)面核苷酸結(jié)構(gòu)（confrontdenucleotidestructure）。第32頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第33頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四帽子結(jié)構(gòu)的功能(1)有助于mRNA越過核膜，進(jìn)入胞質(zhì)；(2)保護(hù)5′不被酶降解；(3)翻譯時(shí)供IFⅢ（起始因子）和核糖體識(shí)別。第34頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四(2)加尾(1)CPSF特殊組分cleavageandpolyadenylationspecificityfactor剪切和多聚腺苷酸化特異因子識(shí)別AAUAAA并指導(dǎo)其它的活性(2)CF(剪切因子)在加尾位點(diǎn)AAUAAA下游11－30nt處剪切RNA；(3)PAP末端腺苷轉(zhuǎn)移酶[poly(A)聚合酶]合成poly(A)尾巴；(4)PBP（poly(A)結(jié)合蛋白與poly(A)結(jié)合，反應(yīng)停止。第35頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第36頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四加Poly(A)的反應(yīng)第一步加一個(gè)短的寡聚A序列（10nt），此反應(yīng)依賴于AAUAAA序列；反應(yīng)由poly（A）聚合酶在特殊因子指導(dǎo)下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的長(zhǎng)度。此反應(yīng)并不需要AAUAAA序列，但需要一個(gè)識(shí)別寡聚A并指導(dǎo)poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。第37頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四加工的要素是：

(1)熱敏因子，功能不祥；

(2)剪切位點(diǎn)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（和序列無關(guān)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)）；(3)U7snRNA,長(zhǎng)56nt,其5’端有一保守序列和H3mRNA剪切點(diǎn)下游的GAAAGA互補(bǔ)。有些mRNA的3’端無poly(A)尾，如在爪蟾卵母細(xì)胞中組蛋白H3的mRNA.成熟時(shí)要切除一段3’端序列。第38頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)內(nèi)含子的剪接一.核酶(Ribozyme)1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜蟲rRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)的；T.Cech由核糖核酸（ribonucleicacid）和酶（enzyme）這兩個(gè)詞“重組”成一個(gè)新的詞：“Ribozyme”；是指本質(zhì)為RNA或以RNA為主含有蛋白質(zhì)輔基的一類具有催化功能的物質(zhì)。第39頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四核酶和傳統(tǒng)酶的區(qū)別：(1)一般的酶是純的蛋白質(zhì)，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA；(2)核酶既是催化劑又是底物。而酶僅催化反應(yīng)。第40頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四核酶發(fā)現(xiàn)的意義（1）突破了酶的概念.是一種自體催化；（2）揭示了內(nèi)含子自我剪接的奧秘；促進(jìn)了RNA的研究。（3）為生命的起源和分子進(jìn)化提供了新的依據(jù)。第41頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四遺傳信息的進(jìn)化路線可能是：RNA→（DNA→表達(dá)）→(DNADNA)→(DNA→表達(dá))↑↓↓↗↓RNARNA表達(dá)

||RNA病毒反轉(zhuǎn)錄病毒EB,HBVDNA病毒第42頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四酶組成的進(jìn)化路線可能是：純RNA→RNA為主→RNA和→蛋白為主→純蛋白蛋白為輔蛋白并重RNA為輔

核酶RNAaseP？端粒酶一般酶類第43頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四生物體組成的進(jìn)化：

蛋白（朊病毒）RNA→RNA+蛋白→RNA·DNA+蛋白DNA+蛋白→

類病毒RNA病毒巨細(xì)胞病毒(HCMV)DNA病毒第44頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四內(nèi)含子剪切相關(guān)的酶第45頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第46頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)1977[美]Sharp&Roberts

同時(shí)發(fā)現(xiàn)了斷裂基因(splitgene)[法]Chambon失機(jī)

雞的輸卵管分泌卵清蛋白、卵粘蛋白和伴清蛋白，而其紅細(xì)胞（鳥類的紅細(xì)胞上有核的）只合成血紅蛋白，那么兩種組織之間DNA有什么不同呢？

southern雜交

Berget，Sharp小組和Roberts小組用R環(huán)法第47頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第48頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第49頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第50頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四DNA和mRNA之間形成特殊的RNA-DNA異源雙鏈分子結(jié)構(gòu)斷裂基因SplitGenes第51頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第52頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四二.內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

(一)內(nèi)含子和外顯子的分布

(二)內(nèi)含子的相對(duì)性第53頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四經(jīng)過刪除和連接，除去無關(guān)的DNA間序（即內(nèi)含子），便形成了成熟的mRNA分子斷裂基因SplitGenes有的內(nèi)含子可編碼內(nèi)切酶。第54頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四三.內(nèi)含子的生物學(xué)意義有的內(nèi)含子可編碼內(nèi)切酶。成熟酶(maturase)

歸巢(Homing)調(diào)控提高進(jìn)化速率

第55頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第56頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第57頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四Homing歸巢在某些內(nèi)含子中含有開放續(xù)框，可產(chǎn)生具有三種功能的蛋白。這些蛋白可使內(nèi)含子（或以其原來的DNA形式，或作為RNA的DNA拷貝）移動(dòng)，使內(nèi)含子可插到一個(gè)新的靶位點(diǎn)，這個(gè)現(xiàn)象叫做歸巢。第58頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第59頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四Crick（1978年）提出了一系列問題（1）剪切若是通過酶，那么這種酶是怎樣識(shí)別RNA上特定的位點(diǎn)？（2）剪切酶有沒有特異性？（3）切除的RNA是以線狀還是環(huán)狀存在的？切下的RNA的命運(yùn)將如何？（4）內(nèi)含子有無調(diào)控作用？（二）邊界序列第60頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四Chambon等發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子切割位點(diǎn)有2個(gè)特點(diǎn)（1）內(nèi)含子的兩個(gè)末端并不存在同源或互補(bǔ)。這就排除了存在二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。（2）連接點(diǎn)具有很短的保守序列，稱為邊界

順序。其規(guī)律稱為GT-AG法則（GT-AGrule)或Chambon法則。左邊的剪接位點(diǎn)稱供體（donor）位點(diǎn)，右邊的剪接位點(diǎn)稱受體（acceptor）位點(diǎn)。第61頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

交界順序第62頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第63頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四三．I類內(nèi)含子的剪接Cech等1981年用四膜蟲分離得到了35S的前體rRNA，它含有一個(gè)長(zhǎng)413bp的內(nèi)含子。此35SrRNA要加入一價(jià)或二價(jià)陽離子及GTP就可以在體外釋放出413b的線性的內(nèi)含子，若繼續(xù)保溫，那么線形內(nèi)含子又可形成環(huán)狀的RNA。這就意味著35SRNA在GTP的作用下可以自我剪接。第64頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四In1983,Cech&Altman,establishedtheexistenceofcatalyticRNAsThomasR.CechUniversityofColoradoUSA,1947-SidneyAltmanYaleUniversity,USA1939-TheNobelPrizeinChemistry1989"fortheirdiscoveryofcatalyticpropertiesofRNA"第65頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第66頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第67頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四重組DNA轉(zhuǎn)化E.coli第68頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第69頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四(一)I類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是

1.其邊界序列為5′U-G3′；

2.具有中部核心結(jié)構(gòu)（Centralcorestrucature）

3.內(nèi)部引導(dǎo)順序（internalguideseguenceIGS）第70頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第71頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第72頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第73頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四(二)I類內(nèi)含子的剪切機(jī)制轉(zhuǎn)酯反應(yīng)(transesterification)

酯鍵從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置。第74頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第75頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

四.Ⅱ類內(nèi)含子的剪接(一)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(1)邊界序列為5′↓GUGCG……YnAG↓；(2)有6個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)；有分支點(diǎn)順序（branch-pointseguence）第76頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第77頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四(二)剪接機(jī)制無需鳥苷的輔助，但需鎂離子的存在。分枝點(diǎn)A的2′-OH對(duì)5′端交界處的磷酸二酯鍵發(fā)動(dòng)親核進(jìn)攻，產(chǎn)生了套索（lariat）結(jié)構(gòu)（圖13-31）；切下的外顯子1其3′-OH繼續(xù)對(duì)內(nèi)含子3′端的交界序列進(jìn)行親核進(jìn)攻，同時(shí)釋放出套索狀的內(nèi)含子。第78頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第79頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第80頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四五.核mRNA的剪接

(一)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.邊界順序:符合GU-AG法則。2.分枝點(diǎn)順序：為Py80NPy87Pu75APy95其中A為百分之百的保守，且具有2′-OH。

3.內(nèi)含子5′端有一保守序列可以和U1snRNA的5′端的保守順序互補(bǔ)第81頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四(二)剪接機(jī)制剪接因子snRNPsU1,U2,U5和U4/U6。第82頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第83頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第84頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第85頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第86頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第87頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四剪接與mRNA出核相關(guān)聯(lián)在完成合成和加工后，mRNA以核蛋白復(fù)合體的形式從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。問題是這些蛋白如何識(shí)別mRNA?如何確保僅加過工的mRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)？部分答案是：剪接體可能形成于轉(zhuǎn)錄完成之前以去除內(nèi)含子，但剪接和出核前應(yīng)具有直接連系。?一個(gè)9個(gè)蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體通過剪接體同RNA結(jié)合，稱為外顯子連接復(fù)合體（exonjunctioncomplex,EJC）第88頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四EJC包含一組稱為REF家族的蛋白質(zhì)（了解得最清楚的成員是Aly）。REF蛋白依次和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（稱為TAP或Mex）相互作用，后者直接負(fù)責(zé)同核孔的相互作用。第89頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四第90頁，共106頁，2023年，2月20日，星期四

六．反式剪接反應(yīng)順式剪接（cis-splici