第五章指紋圖譜

第五章中藥指紋圖譜

FingerprintsofChineseMateriaMedica指紋圖譜的起源與發(fā)展

指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于植物藥質(zhì)量控制，是從20世紀(jì)70年代，色譜技術(shù)的發(fā)展，人們大量采用薄層色譜（TLC）方法，將植物中化學(xué)成分展載于由各種擔(dān)體鋪成的薄層板上。根據(jù)薄層板上的斑點(diǎn)的位置、斑點(diǎn)大小、斑點(diǎn)顏色、斑點(diǎn)數(shù)目的多少進(jìn)行定性鑒別，這種薄層鑒別方法具備了指紋圖譜的特征。第一節(jié)概述中藥指紋圖譜的含義

中藥經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示該中藥特征的共有峰的圖譜。中藥指紋圖譜的特性穩(wěn)定性（重現(xiàn)性）整體性（模糊性）特征性在規(guī)定的方法與條件下，不同的操作者和不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能重復(fù)能反映中藥有效部位所含大部分成分的種類，或指標(biāo)成分的全部能特征地區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣建立中藥指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn)的必要性第一節(jié)概述中藥藥材飲片提取物中成藥特點(diǎn)與問題來源于生物，化學(xué)成分變化大化學(xué)成分復(fù)雜，有效成分尚未闡明多成分、多靶點(diǎn)作用種植技術(shù)與生產(chǎn)過程控制水平差藥品質(zhì)量一致性生物等效性使用安全性單指標(biāo)或少數(shù)指標(biāo)定性、定量分析特征圖譜鑒別指紋圖譜整體成分控制？指紋圖譜中應(yīng)包含的信息對于中藥材和中藥飲片：種的共性，用藥部位的共性，產(chǎn)地的個(gè)性，采收期、炮制方法的個(gè)性信息。對于半成品和中藥制劑：原藥材（甚至輔料）的信息；工藝信息等。藥效信息：藥效信息。中藥指紋圖譜構(gòu)建方法色譜技術(shù)光譜技術(shù)UV

IR波譜技術(shù)MSNMRX-射線衍射法分子生物學(xué)技術(shù)TLCHPLC,LC/MSGC,GC/MSHPCE,CE/MS色譜指紋圖譜薄層色譜●可在同板同時(shí)分析多達(dá)18個(gè)樣品，時(shí)效高●所用的是正相展開劑，其組成變化靈活，可適應(yīng)多種成分的分離●離線操作，即可直觀比較圖譜，又可掃描得到輪廓圖和處理數(shù)據(jù)●占機(jī)時(shí)間短●具有色彩參數(shù)，可獲得色彩豐富的色譜圖像，直觀性強(qiáng)；同時(shí)輔以功能團(tuán)顯色劑還可提示成分的類別，提高鑒別的專屬性?！裾咕嗑窒拊?0cm~20cm

，‘柱效’相對較低，對復(fù)雜組分不提高分離度則難以提取指紋特征的藥材受到限制?！耖_放系統(tǒng)，對環(huán)境溫度、相對濕度要求較高TLC舉例：區(qū)分不同品種TLC舉例：監(jiān)控工藝氣相色譜GasChromatography(GC)●分離效能高●分析速度快●適用于植物的揮發(fā)油成分及其它易揮發(fā)性成分或可轉(zhuǎn)化為可揮發(fā)的成分測定●可提供保留值信息，與質(zhì)譜聯(lián)用，還可提供更豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息

分辨率高，得到的色譜組份非常復(fù)雜，尤其是含揮發(fā)油藥材，單萜類成分組成很不穩(wěn)定，樣品間差異可能很大，處理數(shù)據(jù)和判別相似度時(shí)一定程度的取舍肉桂油的氣相色譜指紋圖譜獨(dú)活GC指紋圖譜羌活GC指紋圖譜毛細(xì)管電泳CapillaryElectrophoresis●分離效能高●分析速度快●高分辨率●可與紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜、拉曼光譜等聯(lián)用，可提供更豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息HPCE指紋圖譜反相高效液相色譜(RP-HPLC)●適用范圍廣●分離性能好●分析速度快●流動(dòng)相選擇范圍寬●靈敏度高●色譜柱可多次重復(fù)使用●流出組分可以收集●采用多種檢測器，可同時(shí)獲取保留值信息和化合物的光譜、質(zhì)譜信息

對較為復(fù)雜的色譜實(shí)驗(yàn)條件要求比較苛刻，由此帶來不同實(shí)驗(yàn)室之間重現(xiàn)性的難度增大IIIIII訶子小訶子大訶子絨毛訶子訶子指紋圖譜（1）

紫外可見分光光度法和紅外光譜法

這兩種方法能夠給出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)信息，但所給出的信息是所有化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)信息的加和，不具備指紋特征，但可作為中藥指紋圖譜研究的輔助方法。（1）

紫外可見分光光度法和紅外光譜法●幾乎所有的物質(zhì)都有特征的紅外光譜?！耠m然植物中藥提取物還是一個(gè)混合物，但是由于不同物質(zhì)的紅外光譜具有加合性，因此，植物中藥提取物的紅外光譜能反映出所有成分的綜合信息因而具有全息光譜的特點(diǎn)。操作簡便（不需要復(fù)雜的提取儀器）、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、溶劑低毒、重復(fù)性高、實(shí)用性強(qiáng)。紅外光譜圖中國藥典規(guī)定：小薊在開花時(shí)采。根據(jù)1384cm-1處吸收峰的有無，可以鑒別其采集時(shí)間是否正確。小薊丁酮提取物的紅外指紋圖譜質(zhì)譜（ＭＳ）按照帶電粒子的質(zhì)荷比（ｍ／ｚ）和其相對豐度大小排列組成圖譜。中藥特征提取物置質(zhì)譜儀中進(jìn)行轟擊裂解為不同的碎片，獲得提取物中化學(xué)成分的MS圖，不同中藥由于所含化學(xué)成分的種類及組成比例的不同，所得質(zhì)譜圖中分子離子峰和碎片離子峰亦不一致。X射線衍射法（XRD）及核磁共振法（NMR）

這兩種方法能給出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)信息，部分信息也可能與特定化學(xué)成分直接關(guān)聯(lián)。但該兩種方法所使用的儀器在國內(nèi)尚未普及，不適應(yīng)該方法的應(yīng)用與推廣。在中藥指紋圖譜研究過程中不建議采用X射線衍射法及核磁共振法。生物學(xué)方法DNA指紋圖譜：用于中藥真?zhèn)?、品種及種質(zhì)資源的鑒定。2.基因組學(xué)指紋圖譜：用以闡明中藥作用的個(gè)體差異和特定基因的作用模式。3.蛋白組學(xué)指紋圖譜：全面提供中藥負(fù)雜物質(zhì)基礎(chǔ)的大量信息，同時(shí)還能提供量效的相關(guān)信息，具有鑒定和研究的雙重作用，對于制劑可以確定該制劑的主要活性物質(zhì)。第二節(jié)中藥指紋圖譜研究程序及技術(shù)要求中藥指紋圖譜供試品溶液10批以上中藥圖譜信息固定產(chǎn)地、采收期和加工炮制的中藥中藥未知檢品預(yù)處理不同產(chǎn)地、采收期和加工炮制的中藥評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)藥效學(xué)試驗(yàn)代表性均一性選擇測試條件方法建立考察測定圖譜參數(shù)圖譜分析相關(guān)性圖譜評價(jià)圖譜測試、相似度評價(jià)方法檢驗(yàn)一、樣品收集最關(guān)鍵的步驟真實(shí)性代表性10批以上原藥材：不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)等二、供試品溶液制備原則1.確保中藥中的主要化學(xué)成分或有效成分在圖譜中得以體現(xiàn)2.所含成分的理化性質(zhì)和檢測方法二、供試品溶液制備1.原藥材、飲片供試品溶液的制備目的：①考察藥材本身質(zhì)量情況，②考察制劑和原藥材的相關(guān)性。盡可能與生產(chǎn)工藝的提取溶劑接近或一致定量操作進(jìn)行二、供試品溶液制備2.半成品/中間體供試品溶液的制備參考制劑和產(chǎn)品制備工藝制備方法必須確保提取物或中間體中主要化學(xué)成分在指紋圖譜中得以體現(xiàn)，取樣與原藥材編號(hào)一致或有明確關(guān)聯(lián)，保證數(shù)據(jù)可追溯。二、供試品溶液制備3.中藥制劑供試品溶液的制備目的：控制最終產(chǎn)品中成分，保證批之間的穩(wěn)定性，確保質(zhì)量。溶液制備：直接使用、稀釋或溶劑提取的方式復(fù)方制劑成分類別差別大，分析條件要求不同，樣品預(yù)處理需分別進(jìn)行，便于獲得2張或2張以上的圖譜。三、對照品（參照物）溶液制備1.參照物的選擇①道地藥材/飲片半成品制劑通常為主要成分

主要活性成分或指標(biāo)成分

考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性，有助于指紋圖譜確認(rèn)。②內(nèi)標(biāo)物2.合適溶劑

四、指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究原則：專屬性、重現(xiàn)性、普遍適用性試驗(yàn)方法:首選色譜法試驗(yàn)條件：建立最佳色譜條件，要使供試品中所含成分盡可能獲得分離，為中藥的指紋圖譜評價(jià)及其品質(zhì)鑒定提供依據(jù)。?

液相色譜

●

色譜柱：比較試驗(yàn)加以選擇流動(dòng)相1流動(dòng)相2流動(dòng)相3流動(dòng)相：至少用三種不同組成比較適宜的柱溫和檢測波長1520253035203210236254365五、方法學(xué)驗(yàn)證

1.穩(wěn)定性試驗(yàn)供試品溶液的穩(wěn)定性表3川芎指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度計(jì)算結(jié)果（n=5）S1S2S3S4S5對照指紋圖譜S11.0000.9970.9950.9950.9970.998S20.9971.0000.9980.9970.9960.999S30.9950.9981.0000.9980.9910.999S40.9950.9970.9981.0000.9900.999S50.9970.9960.9910.9901.0000.994對照指紋圖譜0.9980.9990.9990.9990.9941.000五、方法學(xué)驗(yàn)證2.精密度試驗(yàn)考察儀器的精密度n=5

峰面積比值RSD不大于3％保留時(shí)間：平均相對保留時(shí)間±1min±±五、方法學(xué)驗(yàn)證3.重復(fù)性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性n=5

峰面積比值RSD不大于3％保留時(shí)間：平均相對保留時(shí)間±1min±±注意事項(xiàng)HPLC和GC指紋圖譜：記錄時(shí)間一般為1h；TLC指紋圖譜：須提供從原點(diǎn)至溶劑前沿的圖譜；光譜方法制定指紋圖譜：必須按各種光譜的相應(yīng)規(guī)定提供全譜。對于化學(xué)成分類型復(fù)雜品種，必要時(shí)可建立多張指紋圖譜。六、指紋圖譜的建立和辨認(rèn)要求“準(zhǔn)確的辨認(rèn)”而不是“精密的測量”；比較供試品與對照品的色譜指紋圖譜要求“相似”而不是“相同”。評價(jià)色譜比較的結(jié)果，是根據(jù)其模糊屬性，著眼于宏觀的規(guī)律性的特征分析，即著重辨認(rèn)完整色譜的“圖貌”，而不是求索細(xì)枝末節(jié)。六、指紋圖譜的建立和辨認(rèn)直觀分析比較：看一看量化數(shù)據(jù)比較：算一算（重疊率，相似率等）計(jì)算機(jī)輔助相似度評價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比第四節(jié)中藥指紋圖譜分析與評價(jià)標(biāo)定共有指紋峰，確定參照峰非共有峰總面積不得大于總峰面積的10％計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間、峰面積比給出標(biāo)準(zhǔn)（對照）指紋圖譜及數(shù)據(jù)第四節(jié)中藥指紋圖譜分析與評價(jià)基本參數(shù)的概念

共有指紋峰：多個(gè)樣品中所具有的相同相對保留值的色譜峰。

重疊率：定性依據(jù)，為中藥品種鑒定提供了可靠證據(jù)。

n強(qiáng)峰：占總峰面積的70%以上，峰數(shù)1/5-1/3

反映了主要成分的含量，評價(jià)中藥質(zhì)量的重要信息和依據(jù)。特征指紋峰：

色譜法中共有指紋峰具體規(guī)定：

相對保留時(shí)間的計(jì)算外標(biāo)法：對照品為參照物，以參照物的峰面積作為1內(nèi)標(biāo)法：以共有峰中A值較大，較穩(wěn)定的峰面積為1沒有完全達(dá)到基線分離者，計(jì)算該組峰的總峰面積作為峰面積，同時(shí)標(biāo)定改組各峰的相對保留時(shí)間。

有關(guān)技術(shù)參數(shù)的計(jì)算公式（1）相對保留時(shí)間RTRTR（i）

TR（S）TR（i）各色譜峰的保留時(shí)間；TR（s）參考峰的保留時(shí)間（2）積分相對比值RAA（i）

RA=A（s）A（i）為各色譜峰積分面積；

A（s）為參考峰積分面積。

RRT（i）=重疊率和相似率計(jì)算重疊率=共有峰數(shù)×2指紋圖譜峰數(shù)+供試品峰數(shù)×100%重疊率和相似率計(jì)算特征指紋峰相似率=指紋圖譜中特征指紋峰面積供試品圖譜中特征指紋峰面積×100%中藥注射劑指紋圖譜的評價(jià)以指紋圖譜相似度評價(jià)軟件評價(jià)中間體和注射劑指紋圖譜的相似度應(yīng)不低于0.90。以色譜峰面積的比值評價(jià)峰面積比值的要求：保留時(shí)間小于或等于30分鐘的共有峰：

Ai≥20％At：SD≤±20％；

20％At>Ai≥10％At：SD≤±25％；

10％At>Ai≥5％At：SD≤±30％；

Ai<5％At：峰面積比值不作要求，但必須標(biāo)定相對保留時(shí)間。保留時(shí)間超過30分鐘的共有峰：

Ai≥10％At：按上述規(guī)定執(zhí)行；

Ai<10％At：峰面積比值不作要求，但必須標(biāo)定相對保留時(shí)間。非共有峰面積供試品圖譜與指紋圖譜比較，非共有峰總面積不得大于總峰面積的5％。例：銀杏提取物EGB761EGB761中含總黃酮成分24%，萜類內(nèi)酯6%，原花青素類7.0%，羧酸類成分13.0%，兒茶素類2.0%，非黃酮類苷類20%，高分子化合物4.0%，無機(jī)物5.0%，水分溶劑3.0%，其他3.0%。

有害成分銀杏酸類≤5ppm銀杏葉提取物指紋圖譜蘆丁銀杏葉提取物及制劑指紋圖譜小結(jié)中藥指紋圖譜是一種量化的鑒別手段。指紋圖譜必須符合整體性、特征性、穩(wěn)定性、關(guān)聯(lián)性的基本要求。指紋圖譜與藥效相結(jié)合才有現(xiàn)實(shí)意義。特征指紋峰的含量測定結(jié)合指紋圖譜是理想的質(zhì)量控制模式。同一個(gè)成藥，療效一致嗎？中藥材不同品種、產(chǎn)地、加工：不同廠家：不同工藝：不同輔料：不同來源的丹參藥材指紋圖譜同一廠家不同批次復(fù)方丹參片中丹參指紋圖譜含量一致，療效一致？不同廠家銀杏提取物的色譜指紋圖譜Rb1+Re+Rg1:(A)0.94%;(B)0.52%;(C)0.24%;(D)0.03%DAContent:-Rb10.03%;-Re0%;-Rg10%Total:0.03%Content:-Rb10.5%;-Re0.16%;-Rg10.28%Total:0.94%有效成分含量懸殊的人參

GreatdisparityamongindividualGinsengroots白芷原藥材與硫熏后的藥材質(zhì)量比較

SeriouslossofmajorbioactivecomponentsinBaizhibysulfur-fumigationProcess

AngelicaeFormosanaeRadix(白芷)A:Typicalsampleof‘BaiZhi’B:Sulfurfumedsampleof‘Baizhi’(currentpopularpractice)Thesulfur-fumigatedsampleshowedthemajorcoumar