臨床微生物檢查課件 第3.4章噬菌體細(xì)菌遺傳與變異

第四章噬菌體

（bacteriophage,phage）是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒4/4/20231特性：個(gè)體微小，可以通過細(xì)菌濾器結(jié)構(gòu)簡單，沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和核酸（DNA/RNA）組成嚴(yán)格寄生性，寄生在活的敏感的細(xì)胞內(nèi)分布極廣4/4/20232第一節(jié)噬菌體的生物學(xué)性狀形態(tài)個(gè)體小——電子顯微鏡觀察蝌蚪形、微球形、細(xì)桿形4/4/20233電鏡下見噬菌體×40000電鏡下見噬菌體與宿主菌細(xì)胞膜表面接合×400004/4/20234結(jié)構(gòu)頭部：內(nèi)含DNA/RNA尾部：包括中空尾髓、尾鞘、尾板、尾絲、尾刺等尾絲是吸附宿主細(xì)胞表面特殊受體部位頭部尾部尾鞘收縮尾絲與受體菌表面結(jié)合特異性！4/4/20235化學(xué)組成蛋白質(zhì)構(gòu)成頭部的衣殼及尾部保護(hù)核酸的作用，并決定噬菌體外形和表面特征核酸基因組大小2~200Kb核酸為DNA或RNA多數(shù)噬菌體的DNA為雙鏈DNA多數(shù)RNA噬菌體的RNA為線狀單鏈4/4/20236噬菌體可分為兩種類型：1.毒性噬菌體2.溫和噬菌體/溶原性噬菌體4/4/20237

第二節(jié)毒性噬菌體

(virulentphage)能在宿主菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖,產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌，稱為毒性噬菌體4/4/20238毒性噬菌體的溶菌周期（復(fù)制周期）

吸附→釋放子代噬菌體——噬菌體的復(fù)制周期增殖過程吸附穿入生物合成成熟與釋放4/4/20239吸附噬菌體與細(xì)菌表面受體特異性結(jié)合的過程4/4/202310穿入有尾噬菌體吸附宿主菌后，借助尾部末端含有的溶菌酶，在細(xì)胞壁上溶一小孔，然后通過尾鞘的收縮，將頭部核酸注入菌體內(nèi)無尾與細(xì)桿形噬菌體可以脫殼的方式核酸進(jìn)入菌細(xì)胞內(nèi)4/4/202311毒性噬菌體4/4/202312生物合成轉(zhuǎn)錄形成mRNA，轉(zhuǎn)譯成噬菌體所需的酶、調(diào)節(jié)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白以噬菌體核酸為模板，大量復(fù)制子代噬菌體的核酸4/4/202313成熟與釋放蛋白質(zhì)和核酸合成后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)裝配成成熟的噬菌體子代噬菌體達(dá)一定數(shù)目，菌細(xì)胞裂解，釋放出子代噬菌體，又能感染新的敏感細(xì)菌4/4/2023144/4/2023154/4/2023164/4/2023174/4/202318毒性噬菌體溶菌現(xiàn)象液體培養(yǎng)基：使渾濁菌液變?yōu)槌吻?/4/202319固體培養(yǎng)基：若用適量噬菌體和宿主菌液混合后接種培養(yǎng)，培養(yǎng)基表面可有透亮的溶菌空斑出現(xiàn)

一個(gè)空斑系由一個(gè)噬菌體復(fù)制增殖并裂解細(xì)菌后形成的，稱為噬斑4/4/202320第三節(jié)溫和噬菌體

(temperatephage)

噬菌體基因與宿主菌染色體整合，不產(chǎn)生子代噬菌體，噬菌體DNA能隨細(xì)菌DNA復(fù)制，并隨細(xì)菌的分裂而傳代，稱為溫和噬菌體/溶原性噬菌體4/4/202321溫和噬菌體有三種存在狀態(tài)：游離的具有感染性的噬菌體顆粒宿主菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)類似質(zhì)粒形式的噬菌體核酸前噬菌體4/4/202322前噬菌體整合在細(xì)菌基因組中的噬菌體基因組稱為前噬菌體溶原性細(xì)菌帶有前噬菌體基因組的細(xì)菌稱為溶原性細(xì)菌4/4/202323溫和噬菌體的溶原性周期phage前噬菌體溶原菌4/4/202324溶原狀態(tài)隨著溶原性細(xì)菌的分裂而將噬菌體基因傳代的狀態(tài)為溶原狀態(tài)能經(jīng)歷許多代在某些條件如紫外線、X線、致癌劑、突變劑等作用下，可中斷溶原狀態(tài)進(jìn)入溶菌性狀態(tài)4/4/2023254/4/2023264/4/2023274/4/202328溶原性噬菌體具有溶菌性及溶原性二個(gè)周期4/4/202329溫和噬菌體4/4/202330溶原性轉(zhuǎn)換某些前噬菌體可導(dǎo)致細(xì)菌基因型和性狀發(fā)生改變，稱為溶原性轉(zhuǎn)換白喉棒狀桿菌產(chǎn)生白喉毒素，是因其前噬菌體（β-棒狀噬菌體）帶有毒素蛋白結(jié)構(gòu)基因（tox基因）

4/4/202331

噬菌體的應(yīng)用細(xì)菌的鑒定與分型

噬菌體與宿主菌的關(guān)系具有高度特異性，一種噬菌體只能裂解一種和它相應(yīng)的細(xì)菌，分子生物學(xué)和基因工程研究的重要工具

噬菌體基因數(shù)量少，結(jié)構(gòu)比細(xì)菌和高等細(xì)胞簡單得多，而且容易獲得大量的突變體4/4/202332

細(xì)菌感染的診斷與治療應(yīng)用噬菌體效價(jià)增長試驗(yàn)可檢測標(biāo)本中的相應(yīng)細(xì)菌。在懷疑有某種細(xì)菌存在的標(biāo)本中，加入一定數(shù)量的已知噬菌體，37℃孵育6~8h，再測定該噬菌體的效價(jià)輔助治療，如應(yīng)用銅綠假單胞菌噬菌體治療創(chuàng)口感染但由于噬菌體過于專一，限制了噬菌體在臨床上的廣泛應(yīng)用4/4/202333第五章細(xì)菌的遺傳與變異4/4/202334細(xì)菌變異的現(xiàn)象形態(tài)結(jié)構(gòu)變異抗原性變異菌落變異毒力變異耐藥性變異4/4/202335遺傳性變異：是微生物的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，故又稱基因型變異常發(fā)生于個(gè)別的微生物，不受環(huán)境因素的影響，變異發(fā)生后是不可逆的，產(chǎn)生的新性狀可穩(wěn)定地遺傳給后代4/4/202336非遺傳性變異：微生物在一定的環(huán)境條件影響下產(chǎn)生的變異，其基因結(jié)構(gòu)未改變，稱為表型變異易受到環(huán)境因素的影響，凡在此環(huán)境因素作用下的所有微生物都出現(xiàn)變異，而且當(dāng)環(huán)境中的影響因素去除后，變異的性狀又可復(fù)原，表型變異不能遺傳4/4/202337

BCG：牛型結(jié)核桿菌（有毒株）

膽汁-甘油-馬鈴薯培養(yǎng)

13年，230次傳代

減毒株（BCG）基因型變異：BCG表型變異：細(xì)菌L型4/4/202338第一節(jié)細(xì)菌基因組染色體質(zhì)粒噬菌體基因插入序列轉(zhuǎn)座子整合子主要組成特殊結(jié)構(gòu)4/4/202339細(xì)菌染色體為一環(huán)狀雙股DNA鏈，呈超螺旋形式纏繞成團(tuán)，構(gòu)成核質(zhì)（染色體長度約為菌體總長1000倍）。內(nèi)含細(xì)菌主要的遺傳信息G+菌核質(zhì)連接在中介體上G-菌核質(zhì)連接在細(xì)胞膜某一點(diǎn)上細(xì)菌染色體

4/4/202340質(zhì)粒plasmid

概念：細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，環(huán)狀雙股DNA。攜帶有遺傳信息，控制某些特定的遺傳性狀，可獨(dú)立復(fù)制，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)大質(zhì)?！獛装賯€(gè)基因，占染色體的1%~10%小質(zhì)?！?0~30個(gè)基因，約為染色體的0.5%4/4/202341特征：①自我復(fù)制——可與染色體同步（緊密型）/不同步（松弛型）②決定細(xì)菌某些生物學(xué)性狀③可自行丟失及消除——不影響細(xì)菌存活④可轉(zhuǎn)移性——可以各種方式轉(zhuǎn)移到其它菌⑤質(zhì)?？煞譃橄嗳菪耘c不相容性兩種——幾種質(zhì)粒可存在于同一菌體內(nèi)，稱相容性質(zhì)粒4/4/202342質(zhì)?；蚩删幋a很多重要的生物學(xué)性狀致育質(zhì)粒（F質(zhì)粒）耐藥性質(zhì)粒

接合性耐藥質(zhì)粒（R質(zhì)粒）非接合耐藥性質(zhì)粒毒力質(zhì)粒（Vi質(zhì)粒）細(xì)菌素質(zhì)粒

代謝質(zhì)粒

4/4/202343噬菌體基因組4/4/202344插入序列（insertionsequence,IS）

結(jié)構(gòu)較簡單，長度小于2Kb。只帶有自身插入所需要的酶基因，不帶有任何與插入無關(guān)的基因4/4/202345轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn）結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，分子量大（2Kb以上），除了含有與轉(zhuǎn)位有關(guān)的基因外，還至少攜帶1個(gè)決定細(xì)菌遺傳性狀有關(guān)的基因（如耐藥性基因、重金屬抗性基因、毒素基因等）帶有耐藥性基因的Tn，當(dāng)Tn插入時(shí)，一方面可引起插入基因的失活產(chǎn)生基因突變、另一方面帶入了耐藥基因使細(xì)菌獲得了耐藥性4/4/202346---------------------------------------------------------------------------------------------------------

轉(zhuǎn)座子攜帶的耐藥/毒素基因---------------------------------------------------------------------------------------------------------

Tn1Tn2Tn3AP（氨芐青霉素）

Tn4AP、SM（鏈霉素）、Su（磺胺）

Tn5Tn6Km（卡那霉素）Ble（博來霉素）

Tn1681大腸埃希菌（腸毒素基因）

Tn971、551Em（紅霉素）------------------------------------------------------------------------------------------------------------

常見轉(zhuǎn)座子種類4/4/202347整合子（integron，In）：是一種運(yùn)動(dòng)性的DNA分子，具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)可捕獲和整合外源性基因，使之轉(zhuǎn)變成為功能性基因的表達(dá)單位存在于許多細(xì)菌中，定位于染色體、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，是細(xì)菌固有的一種遺傳單位，可通過捕獲外源性基因來增強(qiáng)生存的適應(yīng)性4/4/202348

是指DNA堿基對的置換、插入或缺失所致的基因結(jié)構(gòu)的變化可分為：點(diǎn)突變、染色體畸變

第二節(jié)基因突變4/4/2023491、自發(fā)突變與誘發(fā)突變2、突變率

細(xì)菌自發(fā)突變率低約為10-9~10-6

，在一些突變劑誘導(dǎo)下突變率可大大提高（10~1000倍）基因突變的規(guī)律4/4/2023503、突變與選擇

細(xì)菌突變隨機(jī)產(chǎn)生，不定向的，不受環(huán)境因素的影響，但在一定條件下被選擇出來4/4/202351突變與選擇證明實(shí)驗(yàn)——影印培養(yǎng)證明：耐藥突變是自發(fā)的、隨機(jī)的，藥物只起選擇作用無抗生素平板

含抗生素平板標(biāo)記點(diǎn)2耐藥菌株

影印用無菌絲絨布影印后絲絨布上對應(yīng)菌落1

含抗生素培養(yǎng)管

（細(xì)菌生長混濁）3

含抗生素培養(yǎng)管（細(xì)菌不生長澄清）34/4/2023524、回復(fù)突變與抑制突變野生型（自然環(huán)境下的表型株）突變型（發(fā)生了基因突變的菌株）細(xì)菌由野生型變?yōu)橥蛔冃褪钦蛲蛔儯袝r(shí)突變株經(jīng)過又一次突變可恢復(fù)野生型的性狀

突變回復(fù)突變野生型突變型4/4/202353突變型細(xì)菌及其分離：突變型細(xì)菌可通過檢測表型的改變加以鑒定：耐藥性突變型藥敏試驗(yàn)營養(yǎng)缺陷突變型營養(yǎng)物質(zhì)篩選條件致死性突變型溫度敏感試驗(yàn)發(fā)酵陰性突變型乳糖發(fā)酵試驗(yàn)4/4/202354第三節(jié)基因的轉(zhuǎn)移和重組基因轉(zhuǎn)移：外源性的遺傳物質(zhì)由供體菌進(jìn)入受體菌細(xì)胞內(nèi)的過程基因重組：轉(zhuǎn)移的基因與受體菌DNA整合在一起的過程基因的轉(zhuǎn)移和重組使受體菌獲得供體菌某些特性4/4/202355外源性遺傳物質(zhì)：

供體菌染色體DNA片段，質(zhì)粒DNA及噬菌體基因等細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移和重組方式：

轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶原性轉(zhuǎn)換、原生質(zhì)體融合4/4/202356（一）轉(zhuǎn)化transformation供體菌裂解釋放的DNA片段被受體菌直接攝取，使受體菌獲得新的性狀

小鼠體內(nèi)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化經(jīng)典試驗(yàn)4/4/202357有莢膜肺炎鏈球菌（活菌）IIIS無莢膜肺炎鏈球菌（活菌）IIR有莢膜肺炎鏈球菌（死菌）IIISIIR活菌+IIIS死菌或IIR活菌+提取的IIISDNA分離出ⅢS型有莢膜的活菌小鼠體內(nèi)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)Griffith(1928)分離出ⅢS4/4/202358

影響因素：供、受菌基因型：同源性；親緣關(guān)系近，轉(zhuǎn)化率高受菌的生理狀態(tài)：

轉(zhuǎn)化因子

感受態(tài)環(huán)境因素：Mg2＋、Ca2＋等可促進(jìn)轉(zhuǎn)化4/4/202359（二）接合conjugation供體菌通過性菌毛將遺傳物質(zhì)（質(zhì)粒）傳遞給受體菌接合性質(zhì)粒——能通過接合方式轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒（F質(zhì)粒、R質(zhì)粒等）非接合性質(zhì)?！荒芡ㄟ^性菌毛在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒4/4/202360細(xì)菌接合示意圖掃描電鏡15000×4/4/202361F質(zhì)粒（致育質(zhì)粒）接觸：細(xì)胞質(zhì)溝通轉(zhuǎn)移：F質(zhì)粒進(jìn)入F－菌，1分鐘完成復(fù)制：F－菌轉(zhuǎn)為F＋菌4/4/202362Hfr（高頻重組株）：F質(zhì)粒與染色體整合→Hfr具有高頻率轉(zhuǎn)移自身染色體至F-菌的能力細(xì)菌染色體轉(zhuǎn)移頻率高，F(xiàn)質(zhì)粒低受體菌獲得供體菌性狀4/4/202363Hfr轉(zhuǎn)移細(xì)菌染色體過程4/4/202364F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移與復(fù)制①形成高頻重組株②HfrHfrHfr③形成F’質(zhì)粒F’從Hfr上脫離的F’4/4/202365

帶有F質(zhì)粒、Hfr、F’質(zhì)粒的細(xì)菌均是F+菌，有性菌毛，可與F-

菌接合4/4/202366R質(zhì)粒的傳遞

目前，臨床上多重耐藥菌株的出現(xiàn)與R質(zhì)粒通過接合傳遞密切相關(guān)R質(zhì)粒組成：

①耐藥傳遞因子（RTF)

RTF類似F因子，可編碼產(chǎn)生性菌毛并以接合方式轉(zhuǎn)移②耐藥決定因子（r-det）

r決定因子兩端的IS可與RTF相連；且可有多個(gè)Tn連接排列是造成多重耐藥的原因4/4/202367RTFISR決定因子Tn9Tn4Tn5Tn9耐氯霉素Tn4耐氨芐青霉素、鏈霉素等Tn5耐卡那霉素R質(zhì)粒組成示意圖4/4/202368（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)transduction以噬菌體為載體，將供體菌的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到受體菌中，使受體菌獲得新的遺傳性狀4/4/202369根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因片段的性質(zhì)范圍，可將轉(zhuǎn)導(dǎo)分為兩種：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA可是供體菌染色體上的任何部分，也可以是質(zhì)粒DNA局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA只限供體菌染色體上的特定基因4/4/202370普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖整合成功完全轉(zhuǎn)導(dǎo)整合失敗流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體DNA細(xì)菌DNA細(xì)菌被裂解感染新的細(xì)菌供體菌DNA與受體菌DNA整合4/4/202371普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)可轉(zhuǎn)移較大片段的DNA，而且由于噬菌體衣殼的保護(hù)，不易被降解，故轉(zhuǎn)化效率較高4/4/202372⒉局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)由溫和噬菌體介導(dǎo)所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段只限于供體菌染色體中個(gè)別特定的基因（如大腸桿菌λ噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的半乳糖酶基因或生物素基因）

4/4/202373galbioλ噬菌體DNA正常偏離galbioλ噬菌體DNAgalbioλ噬菌體DNAgalbioλ噬菌體DNAgalbioλ噬菌體DNAgalbioλ噬菌體DNA局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖4/4/202374（四）溶原性轉(zhuǎn)換

lysogenicconversion概念溫和噬菌體以前噬菌體形式存在于細(xì)菌染色體中，并導(dǎo)致細(xì)菌基因型發(fā)生改變，使溶原性細(xì)菌獲得了新的性狀

4/4/202375不產(chǎn)毒素白喉棒狀桿菌（無致病性）

攜帶

β棒狀桿菌噬菌體

產(chǎn)毒素性白喉棒狀桿菌