熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)課件

熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)蔡司光學(xué)儀器4/3/20231熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)什么是顯微鏡熒光檢測(cè)？

一般熒光顯微鏡熒光觀察，是借標(biāo)本:1）本身的熒光反應(yīng)物質(zhì)吸收熒光光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象，或2）利用組織及細(xì)胞內(nèi)某成分可與熒光染料（熒光色素）結(jié)合并受到熒光激發(fā)后所出現(xiàn)特定顏色的熒光供作觀察。作出定性、定位（根據(jù)熒光圖象的形態(tài)學(xué)特征和顏色）和定量（根據(jù)熒光的亮度）。其中：1）為自發(fā)熒光，2）為繼發(fā)熒光。4/3/20232熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)落射熒光與透射光觀察的區(qū)別

4/3/20233熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光熒光的性質(zhì)吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長(zhǎng)＞激發(fā)波長(zhǎng)（損失熱能）熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率4/3/20236熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高（放大作用）對(duì)細(xì)胞的刺激小（可以活體染色）能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察——熒光素?zé)晒獾挠袩o(wú)、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別——抗體熒光等發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析4/3/20237熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)組織固定活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會(huì)因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織學(xué)改變，并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)的細(xì)胞器變化和細(xì)胞組織的形態(tài)改變直至腐敗自溶。選擇最佳固定液標(biāo)準(zhǔn)是：（1）最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中是禁用的；（3）不要用可能帶有自發(fā)熒光的固定劑，如帶有苦味酸的固定劑，還有甲醛升汞固定液，會(huì)使上皮細(xì)胞產(chǎn)生非特異性熒光；（4）固定劑的選擇、固定時(shí)間、溫度和PH值都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4/3/20239熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)單純固定液（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿(mǎn)足常規(guī)HE及免疫組化、PCR等工作。中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對(duì)組織抗原性的保存均優(yōu)于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處，保存時(shí)間不超過(guò)一個(gè)月。甲醛（40%）100ml無(wú)水磷酸氫二鈉6.5g磷酸二氫鈉4.0g蒸餾水900ml4/3/202310熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)單純固定劑（2）乙醇固定液：使用時(shí)以80%-95%的濃度為宜，具有硬化、固定、脫水等作用，對(duì)組織滲透力較弱，因此很少單獨(dú)使用，但其保存組織中的核酸強(qiáng)于中性甲醛，故常用于有核酸操作的實(shí)驗(yàn)或檢查，如果用于證明尿酸結(jié)晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定組織。（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培養(yǎng)細(xì)胞的固定。4/3/202311熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)混合固定液（3）Bouin固定液：特別適用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對(duì)組織固定較均勻，收縮很少，不會(huì)使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。飽和苦味酸水溶液（約1.22%）75ml甲醛25ml冰醋酸5ml（4）Carnoy固定液：穿透能力強(qiáng)，可很好的固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，特別適用于固定外膜致密的組織，也適用于糖原及尼氏小體的固定。無(wú)水乙醇60ml氯仿30ml冰醋酸10ml4/3/202313熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)混合固定液（5）Zenker固定液：經(jīng)此液固定的標(biāo)本，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較高且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽(yáng)光，以免引起化學(xué)變化而失效。升汞5.0g重鉻酸鉀2.5g硫酸鈉1.0g蒸餾水（加至）100ml4/3/202314熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)取材組織取材：按病理診斷和研究的目的和要求，從標(biāo)本上切取適當(dāng)大小和數(shù)目的組織塊，供后續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診斷以及相關(guān)研究。細(xì)胞標(biāo)本的取材（1）貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞（2）懸浮的培養(yǎng)細(xì)胞：沉淀涂片，細(xì)胞離心涂片器（cytospin），載玻片上涂粘附劑—多聚賴(lài)氨酸（0.01~0.5%），甲醛-明膠，鉻礬明膠，Vectabond試劑（3）體液沉淀涂片法（4）穿刺吸取涂片法（5）印片法4/3/202315熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)包埋組織塊經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑（如石蠟、樹(shù)脂、塑料等）將其包制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過(guò)程稱(chēng)為包埋。包埋步驟先將熔化的石蠟注入包埋托內(nèi)，而后用鑷子將經(jīng)過(guò)浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷臺(tái)商，用鑷子輕按組織塊，以達(dá)到組織塊平整，蓋上脫水盒底，再加好石蠟，移至冷凍臺(tái)上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的不同，選擇大小型號(hào)合適的包埋托；有要求直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍停片刻，以使組織組織在蠟?zāi)龝r(shí)立住，達(dá)到立埋的要求。4/3/202317熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)切片冰凍切片為免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠比較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)該采用冰凍切片。新鮮的組織及已經(jīng)固定的組織均可作冰凍切片。冰凍切片后如果不染色，必須吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存于冰箱中保存。要注意刀片等接觸陽(yáng)性物質(zhì)的污染問(wèn)題。4/3/202318熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)切片石蠟切片其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值，能連續(xù)切片（薄片），組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同，主要是要在比較低的溫度下進(jìn)行。①脫水、透明等過(guò)程應(yīng)在4℃下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失；②組織塊大小應(yīng)限于2cmx1.5cmx0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸臘；③浸臘、包埋過(guò)程中，石蠟應(yīng)該保持在60℃以下，以熔點(diǎn)低的軟臘最好（低溫石蠟包埋）；④石蠟切片應(yīng)放在37℃恒溫箱過(guò)夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長(zhǎng)期貯存，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用；⑤冷凍干燥包埋法：可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。4/3/202319熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)封片封片劑常用甘油和0.5mol/LpH9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液。如需將染色后的樣品保存一段時(shí)間，可以用指甲油在蓋玻片周?chē)忾]。暗處保存。一般無(wú)須脫水透明以及用樹(shù)膠封片。如果必須脫水透明，封片最好用DPX。由于激光共聚焦顯微鏡觀察采集圖象很快，所以一般用PBS或生理鹽水也可以。4/3/202321熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)組織和細(xì)胞的自發(fā)性熒光檢測(cè)1、動(dòng)物組織一般呈現(xiàn)弱淡蘭色熒光，其中彈性纖維的熒光較強(qiáng)；2、紅細(xì)胞血紅蛋白中的卟啉呈紅色熒光，但在正常情況下，卟啉和鐵離子相結(jié)合，鐵離子有抑制熒光作用，所以紅細(xì)胞不發(fā)熒光。如在血液中加酸使鐵離子游離，或缺鐵性貧血，紅細(xì)胞可呈紅色熒光；3、細(xì)胞內(nèi)的脂褐素呈棕黃色的自發(fā)熒光，例如心肌細(xì)胞核兩側(cè)的肌漿內(nèi)，隨著年齡的增長(zhǎng)或在某些疾病的情況下，可見(jiàn)較大量的棕黃色脂褐素?zé)晒忸w粒；4、某些腫瘤細(xì)胞在紫外或藍(lán)光激發(fā)可呈現(xiàn)明顯的自發(fā)熒光，可作原位腫瘤的早期診斷；5、維生素A呈綠色的自發(fā)性熒光。如大鼠食入維生素A后，在肝細(xì)胞、Kuffer細(xì)胞、腎上腺束狀帶細(xì)胞、肺和腎的間質(zhì)細(xì)胞、卵巢間質(zhì)細(xì)胞和黃體細(xì)胞等的胞質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)到維生素A的綠色熒光；6、某些藥物也可呈現(xiàn)一定顏色熒光，如奎寧為綠色熒光，四環(huán)素為黃色熒光。四環(huán)素能與骨基質(zhì)中的鈣結(jié)合，利用這一特性，可以用四環(huán)素飼養(yǎng)動(dòng)物以觀察新骨質(zhì)的形成。另外，四環(huán)素和癌細(xì)胞有較大的親合力，能在惡性腫瘤內(nèi)形成黃色的熒光灶；7、有機(jī)體的單胺神經(jīng)原、消化道和呼吸道粘膜內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的內(nèi)源性生物胺—兒茶酚胺、5-羥色胺和組織胺等與某些醛類(lèi)物質(zhì)在一定條件下可發(fā)生縮合反應(yīng)而呈現(xiàn)熒光。4/3/202322熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)熒光組織細(xì)胞染色（熒光探針檢測(cè)，熒光標(biāo)記檢測(cè)）4/3/202323熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞骨架F-actin（F-肌動(dòng)蛋白）染色：用FITC或Rhodamine標(biāo)記的Phalloidin（鬼筆環(huán)肽）。F-肌動(dòng)蛋白是大多數(shù)真核細(xì)胞中以聚合絲形式存在的肌動(dòng)蛋白。Phalloidin能與細(xì)胞內(nèi)的F-actin特異性結(jié)合。激發(fā)光激發(fā)Phalloidin上結(jié)合的熒光標(biāo)記，使F-肌動(dòng)蛋白被觀察到。FITC或Rhodamine標(biāo)記的Phalloidin，溶于甲醇中制成貯存液（200u/ml），染色時(shí)終濃度為5u/ml。細(xì)胞涂片→PBS洗滌→2%戊二醛固定15分鐘→PBS洗滌→0.2%TritonX-100抽提2分鐘→PBS洗滌→FITC或Rhodamine標(biāo)記的Phalloidin室溫20分鐘→PBS洗滌，觀察。

4/3/202325熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)FluorochromesandStainsDAPI,Hoechst,SYTO16:semipermeantandpermeantDNAstain,apoptosisGFP:usedinlivingsystemsasagene/proteinreporterLuciferyellow,Fluorogold:neuronaltracerMitoFluorgreen,MitoTrackergreen:mitichondrialmarker4/3/202326熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞熒光離子探針游離鈣離子含量測(cè)定：有Fura2AM,Indo1和Fluo3AM,前兩者激發(fā)波長(zhǎng)為紫外，而且均是雙激發(fā)波長(zhǎng)的比率熒光，所以目前一般在熒光顯微鏡觀察，特別是激光共聚焦顯微鏡觀察中用Fluo3AM。Ex/Em:506/526。Fluo3本身不發(fā)熒光，只有當(dāng)與胞漿內(nèi)游離鈣離子結(jié)合后，受激發(fā)光照射才發(fā)出熒光。Fluo3AM不能與游離鈣離子結(jié)合，但它能穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（Fluo3不能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞），進(jìn)入細(xì)胞后的Fluo3AM中的AM被細(xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解，變?yōu)镕luo3，F(xiàn)luo3與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)弱直接反應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子的含量。Fluo3AM染色：Fluo3AM用DMSO配成貯存液，冰凍保存，使用時(shí)終濃度為1uM。染色一般為37℃，30~45分鐘。Fluo3染色細(xì)胞內(nèi)鈣離子，可以通過(guò)時(shí)間掃描，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量和分布的動(dòng)態(tài)觀察。細(xì)胞內(nèi)pH的測(cè)定：SNAFL：雙發(fā)射波長(zhǎng)比率熒光。Ex:514(488),Em:580/640BCECF：雙激發(fā)波長(zhǎng)比率熒光。Ex:490/440,Em:5304/3/202329熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)PhysiologyProbesIndo-1,Fura-2:dualemissionordualexcitationcalciumprobeCalciumgreen,Fluo-3:singlewavelengthcalciumprobeBCECF:singleordualexcitationwavelengthpHprobeJC-1:potentialsensitivemitochondrialdualemissionCalcein:volumechanges,gapjunctions,liposomes,permeabilityLysosensorBlueDND-192,LysoSensorGreenDND-153:lysosomalmarkerNBD-C6ceramide:GolgimarkerRhodamine-123:mitochondrialmarker4/3/202330熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)SNARF:pHindicatoremissionratioFM1-43,RH-414:plasmamembraneFurared:calciumindicator,decreasedfluorescenceonbindingDIC18(3),DIC16(3):ERmarkerLysoTrackerYellowDND-68:lysosomalmarkerMitoTrackerOrange,RhodamineBHexylester,Tetramethylrosamine:mitochondrialmarker4/3/202331熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)Mouse;hippocampalneurons;fluorescenceofGFPShigeoOkabeDepartmentofAnatomyandCellBiologyTokyoMedicalandDentalUniversity4/3/202332熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出熒光，可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。（較常用）熒光抗原法：用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的熒光素以異硫氰酸熒光素（FITC綠色熒光）、羅丹明（TRITC橙紅色熒光）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC橙紅色熒光），Cy3（橙紅色熒光），Cy5（紅色熒光），德克薩斯紅（橙紅色熒光）較常用。4/3/202333熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法四種。1、直接法：1）檢查抗原法：（最早的方法）用已知的特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見(jiàn)抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。該方法很特異和簡(jiǎn)便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。2）檢查抗體法：將抗原標(biāo)記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體定位檢測(cè)出來(lái)。4/3/202334熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)2、間接法：1）檢查抗體法（夾心法）先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間。2）檢查抗體法用已知抗原細(xì)胞或組織標(biāo)本的切片，加上待測(cè)血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測(cè)人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見(jiàn)抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是檢驗(yàn)血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。4/3/202335熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)3）檢查抗原法雙薄片先用特異性（對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱(chēng)第一抗體）與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（第二抗體，有種特異性）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個(gè)分子結(jié)合3~5個(gè)分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合3~5個(gè)分子的熒光抗體，所以與直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3~4倍。靈敏度高，只需制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示。是目前使用得最廣泛的技術(shù)。缺點(diǎn)為容易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。4/3/202336熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)3、補(bǔ)體法1）直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法用抗補(bǔ)體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng)，而形成抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物—抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽(yáng)性熒光的部位就是免疫復(fù)合物存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢等。2）間接檢查組織內(nèi)抗原法常將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原補(bǔ)體抗體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原抗體—抗補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物。此法優(yōu)點(diǎn)是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來(lái)源的第一抗體的標(biāo)記顯示。缺點(diǎn)為容易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。4/3/202337熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)4、雙（多）重免疫熒光標(biāo)記法在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需同時(shí)檢查兩種或兩種以上抗原時(shí)，要進(jìn)行雙（多）重?zé)晒馊旧?。一般均采用直接法。將這些熒光抗體（如抗A和抗B）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上（也可分別加），孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體。不同熒光標(biāo)記抗體最好用波長(zhǎng)范圍分得比較開(kāi)的熒光素。如綠色與紅色搭配。4/3/202338熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)4/3/202339熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)研究中常用熒光染料和探針細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白免役熒光標(biāo)記：與抗體耦聯(lián),直標(biāo):一抗+熒光探針間標(biāo):二抗+熒光探針如:微管蛋白tublin(抗tublin抗體+熒光探針)肌動(dòng)蛋白actin(Palloidine+熒光探針)1．染色切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)的熒光抗體，在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。

2．洗片傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢

4/3/202340熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)研究中常用熒光染料和探針細(xì)胞膜表面受體 配體+熒光探針如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)標(biāo)記Gm1:霍亂毒素受體霍亂毒素+FITC1.切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/lpH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

2.再滴加間接熒光抗體，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

4/3/202341熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)研究中常用熒光染料和探針1.Amine-ReactiveProbes與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等

Green

Red

Fura-red

FITC494/518TRITC544/572Cy5650/690(異硫氰基熒光素)(四甲基異硫氰基羅丹明)AlexaFluor488488/530PE565/578(藻紅蛋白)TexasRed595/615(德州紅)Cy3558/568BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR592/618

4/3/202342熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)研究中常用熒光染料和探針2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針1)線粒體MitochondriaRodamin123505/534，可染活細(xì)胞，陽(yáng)離子,可檢測(cè)線粒體膜電位,且在多數(shù)細(xì)胞中停留時(shí)間短JC1線粒體膜電位低時(shí)為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位高時(shí)為多聚體490/590發(fā)紅光可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測(cè)線粒體膜電位最 佳探針MitotrackerGreenFM490/516,染活細(xì)胞或固定細(xì)胞, 穩(wěn)定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange還原型,只能染活細(xì)胞4/3/202343熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)研究中常用熒光染料和探針2)溶酶體

Lysosome

中性紅541/640:微偏堿性,可標(biāo)記溶酶體等酸性器官

為非特異性AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活細(xì)胞

LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)EndoplasmicReticulumDiOC6484/500:非特異性,較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),較低濃度標(biāo)記線粒體4)高爾基體GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死細(xì)胞4/3/202344熒光細(xì)胞化學(xué)樣品制備和檢測(cè)技術(shù)研究中常用熒光染料和探針細(xì)胞器的單克隆抗體5)細(xì)胞核PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死細(xì)胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/617DNA/RNA死細(xì)胞Hochest33342352/461DNAA-T活細(xì)胞Hochest33258352/461DNAA-T