腫瘤醫(yī)院-egfr研究報(bào)告

臨床產(chǎn)品名稱：人EGFR20種突變檢測試劑盒（PCR-熒光探法型號規(guī)格：24人份/產(chǎn)品申請人（蓋章：華大吉比愛生物技 研究單位：福建省腫瘤醫(yī)院主要研究者（簽字統(tǒng)計(jì)學(xué)負(fù)責(zé)單位（蓋章：福建省腫瘤醫(yī)院統(tǒng)計(jì)學(xué)（簽字：研究開始日期 研究完成日期 原始資料保存地點(diǎn)：福建省腫瘤醫(yī)院 目研 試驗(yàn)研究人 縮略 一、引 二、研究目的和內(nèi) 三、試驗(yàn)管 四、試驗(yàn)設(shè) 五、有關(guān)臨床研究中特別情況的說 六、記錄保 七、臨床研究結(jié)果及分 八、討論和結(jié) 九、附 研究表明表皮因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)突變與肺癌對與抗腫瘤藥物酪氨酸激酶抑制劑的敏感性有關(guān)。根據(jù)國內(nèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cellcarcinoma,NSCLC)患者中EGFR突變率在30%左右，其中21號L858R19號外顯子的缺失(19deletion,19del)EGFR90%以上。而肺癌的前期臨床試驗(yàn)表明，在含鉑類藥物聯(lián)合化療失敗后，易瑞12%-18%50%7個(gè)月左右，受試者的癥狀改善且安全性良好，所以EGFR突變檢測對于臨床醫(yī)生進(jìn)行肺癌的個(gè)體化治療具有重要的參考價(jià)值。至目前為止東方人NSCLC的有效率多在25%～35%，而西方人的有效率僅在8%～15%。因此，EGFR突變檢測，尤其是19號和21號外顯子突變檢測對于臨床醫(yī)生進(jìn)行肺癌的化治療具有重要的參考價(jià)值。華大生物技術(shù)依托自身現(xiàn)有技術(shù)，全面整合各種優(yōu)勢資源，研發(fā)準(zhǔn)確、可靠且適合臨床應(yīng)用檢測的人EGFR20種突變檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，為晚期非小細(xì)胞肺癌患者的靶向診斷治療提供輔助。不精密度，各種試劑穩(wěn)定性良好。有關(guān)臨床性能評估工作在首都醫(yī)學(xué)附屬胸科醫(yī)院進(jìn)行，本試劑盒的臨床靈敏度、臨床特異性從而驗(yàn)證本產(chǎn)品與已上市產(chǎn)品的等通過對福建省腫瘤醫(yī)院的259份臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合分析，華大生物技術(shù)生產(chǎn)的人EGFR20種突變檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）相對于試劑盒檢測EGFR_19del的陽性符合率為93.65%，符合率為97.45%，總符合率為96.53%，Youden91.10%，KappaKappa=0.906>0.7595%的置信區(qū)間內(nèi)，表明試劑和試劑檢測EGFR_19del有較好的一致性；華大吉比愛生物技術(shù)生產(chǎn)的人EGFR20種突變檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）相對于試劑盒檢測EGFR_L858R的陽性符合率為92.00%，符合率為98.56%，97.30%，Youden90.56%，KappaKappa=0.913>0.75，表明在95%的置信區(qū)間內(nèi)，表明試劑和試劑檢測EGFR_L858R有較好的一致性綜上所述，華大生物技術(shù)的人EGFR20種突變檢測試劑男，醫(yī)學(xué)，副醫(yī)師，教授，導(dǎo)師。現(xiàn)任長、病理科行政副、福省腫 分子病理研究室政 、腫瘤組織庫織病理感，尤其擅長淋巴生polymerasechainreaction(PCR) Real-timePCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCRepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)表皮生長因子受體一、引言肺癌是嚴(yán)重危害人民生命和健康的常見病。肺癌在城市占 的38.08%,女性患者約為16均居首位肺癌治療效果多年來一直沒有顯著提高總治愈率僅為10%左右其原因一方面由于其生物學(xué)特性十分復(fù)雜惡性程度高且多藥藥另一方面關(guān)鍵還在80%以上的肺癌在確診時(shí)已屬晚期晚期非細(xì)小性肺癌的傳療方法是以化療為主的綜合治療，經(jīng)年來雖然不斷有新型的化療藥物被發(fā)現(xiàn)，但是其療效沒有明顯的提高。針對表皮生長因子受體(pidermalgrowthftorrpto,E)的靶向治療藥物酪氨酸激酶抑制劑因其療效好、副作用小，在全世界范圍內(nèi)應(yīng)用開來，目前在臨床廣泛使用的藥物有吉非替尼(Ir)和厄洛替尼。研究表明表皮因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)突變與肺癌對與酪氨酸激酶抑制劑的敏感性有關(guān)。根據(jù)國內(nèi)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國非小細(xì)胞肺癌EGFR突變率在30%左右其中21號外顯子L858R和19號外顯子的缺失是主要突變位點(diǎn)，占EGFR總突變的90%以上。而肺癌的前期臨床試驗(yàn)表明，在含鉑類藥物聯(lián)合化療失敗后，仍有12%-18%的客觀有效率，疾病控制率在50%左右，中位生存期約為7個(gè)月左右，受試者的癥狀改善且安全性良好，所以EGFR突變檢測對于臨床醫(yī)生進(jìn)行肺癌的化治療具有重要的參考價(jià)值。至目前為止東方人NSCLC的有效率多在25%～35%，而西方人的有效率僅在8%～15%。因此，EGFR突變檢測，尤其是19號和21號外顯子突變檢測對于臨床醫(yī)生進(jìn)行肺癌的化治療具有重要的參DNA法是目前臨床檢測突變的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)方法，但由于其分辨度低（20%以瘤細(xì)胞用于后續(xù)檢測；此外，由于需要擴(kuò)增后再進(jìn)序，所需檢測時(shí)間長且費(fèi)用高，目前臨側(cè)重于使用基于熒光定量PCR技術(shù)核酸檢測技術(shù)的檢測試劑盒已經(jīng)批準(zhǔn)臨床使用的試劑盒也主要集中于EGFR的19號和21號外顯子，主要廠家有：北京金菩嘉醫(yī)療科技的EGFR突變檢測試劑（熒光PCR法可檢測EGFR19、21外顯子4個(gè)常見突變型；廈門生物科技人類EGFR京雅康博生物科技的人EGFR突變檢測試劑盒(熒光PCR法)可檢測EGFR18、19、21外顯子12種突變型；源奇生物科技人EGFR突為了考核華大生物技術(shù)研制的人EGFR20種突變檢測試報(bào)告中國醫(yī)學(xué)協(xié)和醫(yī)院作為臨床牽頭單位組織此次臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施二、研究目的和內(nèi)容研究目本臨床試驗(yàn)?zāi)康臑榭己巳A大生物技術(shù)生產(chǎn)的人EGFR研究內(nèi)本研究收集了肺癌患者手術(shù)切除腫瘤組織石蠟樣本，采用對比試劑對樣本中EGFR樣本，進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測仍不一致的經(jīng)第試劑進(jìn)行驗(yàn)證；通過對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評價(jià)本試劑盒檢測EGFR20種突變的臨床靈敏度、臨床特異性、檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而驗(yàn)證本產(chǎn)品與已上市產(chǎn)品的等效性；在此基礎(chǔ)上出具臨床。三、試驗(yàn)管理承擔(dān)臨床研究機(jī)構(gòu)的臨床實(shí)驗(yàn)單位及主要參加人單位為福建省腫瘤醫(yī)院。室內(nèi)質(zhì)量控制情本有嚴(yán)密的體系，全部實(shí)驗(yàn)均按科室相關(guān)操作規(guī)范進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)記錄參加和省臨檢中心室間質(zhì)量評價(jià)，測定項(xiàng)目合格編訂作業(yè)指導(dǎo)書，對儀器進(jìn)行定期、校準(zhǔn)和功能檢查的操作和測量操作規(guī)范。數(shù)據(jù)管理及統(tǒng)計(jì)情研究過程中發(fā)生的問題及處理措四、試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案檢測嚴(yán)格按照華大生物技術(shù)生產(chǎn)的人EGFR20種突變檢匯總檢測結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)于臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究方法選擇樣本選擇：肺癌患者，包括鱗癌、等樣本、保存：試驗(yàn)樣本均來源于福建省腫瘤醫(yī)院臨床檢測石蠟包埋組織樣本樣本量：259本試劑盒的臨床試驗(yàn)選擇市場占有率較高的廈門生物科技的人類(熒光PCR法（國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))2010第號）作為對比試劑，以該對比試劑檢測結(jié)果評價(jià)華大生物技術(shù)生產(chǎn)的人EGFR20種突變檢測試劑盒（PCR-第試劑驗(yàn)證：對比對結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測仍不一致樣本，選用酶切的方法進(jìn)行驗(yàn)證。臨床用產(chǎn)品被測試試劑人EGFR20種突變檢測試劑（PCR-熒光探針法）批號 規(guī)格：24人份/盒，均為華大生物技術(shù)生產(chǎn)，效期9個(gè)月，保存對比試劑：廈門生物科技的人類，批號 人份/盒，效期：8第驗(yàn)證：酶切熒光定量PCR儀ABISteponeplusABI7500PCR漩渦振蕩臨床試驗(yàn)方案由華大生物技術(shù)與福建省腫瘤醫(yī)院參照《體外診試驗(yàn)用試劑的制造、處理、均應(yīng)符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定研究者應(yīng)保證將數(shù)據(jù)真實(shí)、準(zhǔn)確、完整、及時(shí)、合法地載入試驗(yàn)記錄和臨床報(bào)告中監(jiān)查員應(yīng)與研究者迅速發(fā)生的嚴(yán)重不良，采取必要的措施以保證臨床試 符合率：試驗(yàn)檢出的樣本占對比試劑檢出樣本總數(shù)的比例Youden指數(shù)：是陽性符合率與符合率之和減1，用于表示診斷準(zhǔn)確度。 陽性符合率=A/(A+C符合率=D/(B+D總符合率=(A+DA+B+C+DYouden指數(shù){A/(A+C1D/(B+DKappa五、六、表一福建省腫瘤醫(yī)院使用和試劑盒檢測肺癌石蠟樣本中EGFR-19del突變結(jié)果54 259對于19del缺失突變檢測中：試劑盒檢測肺癌石蠟樣本中19del為陽性的樣本共63例（突變類型見附件一；而試劑檢測19del為陽性例數(shù)64例。4例試劑盒見附件二，3例酶切法為19del突變陽性樣本（包括2例E746_A750（2、1例E746_A750（1，119del陽性而試劑盒試劑檢測19del，采用酶切法進(jìn)行檢測，4例樣本19del缺失突變陽性（2E746_A750（2）樣本，1E746_T751>A樣本，1，119del陽性符合率19del符合率19del總符合率19delYouden指數(shù)={93.651-97.45對稱值近似值近似值 有效案例中的將福建省腫瘤醫(yī)院樣本用試劑和試劑共同檢測259例樣本的檢測結(jié)果使用SPSS軟件中Kappa檢驗(yàn)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見圖1。試劑和試劑檢測EGFR突變的Kappa檢驗(yàn)結(jié)果0.906>0.75，表明試劑和試劑檢測19del有較好的一致性。表二福建省腫瘤醫(yī)院使用和試劑盒檢測肺癌石蠟樣本中EGFR-L858R突變結(jié)果34 在L858R的檢測中：試劑盒檢測肺癌石蠟樣本中L858R為陽性的樣本共50例；而試劑檢測L858R為陽性例數(shù)49例。4例試劑盒試劑檢測L858R陽性而吉愛試劑檢測L858R，采用酶切法進(jìn)行檢測，1例酶切法為野生型，2例酶切法為L858R陽性，1例樣本濃度低達(dá)不到要求，可能由于經(jīng)酶切后，樣本度偏低。3例試劑檢測L858R陽性而試劑盒試劑檢測L858R，采用酶切法進(jìn)行檢測，1例酶切法為L858R陽性，2例樣本濃度低達(dá)不到要求。人EGFR20種突變檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）檢測EGFR臨床分析性能L858R陽性符合率=46/50×100%=92.00%L858R符合率=206/209×100%=98.56%L858R總符合率=(46+206)/259×100%=97.30%L858RYouden指數(shù)={92.001-98.56對稱值近似值近似值 有效案例中的圖2試劑（GBI）與Sanger法檢測K-ras突變經(jīng)SPSS軟件Kappa檢驗(yàn)結(jié)將福建省腫瘤醫(yī)院樣本用試劑和試劑共同檢測259例樣本的檢測結(jié)果使用SPSS軟件中Kappa檢驗(yàn)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見圖2。試劑和試劑盒檢測EGFR突變的Kappa檢驗(yàn)結(jié)果0.913>0.75，表明試劑和試劑檢測L858R有較好的一致性。八、討論和結(jié)論通過對福建省腫瘤醫(yī)院的259份臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合分析，華大生物技術(shù)生產(chǎn)的人EGFR20種突變檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）相對于劑盒檢測EGFR_19del的陽性符合率為93.65%，符合率為97.45%，總符合率為96.53%，Youden91.10%，KappaKappa=0.906>0.7595%的置信區(qū)間內(nèi)，表明試劑和試劑檢測EGFR_19del有較好的一致性；華大吉比愛生物技術(shù)生產(chǎn)的人EGFR20種突變檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）相對于試劑盒檢測EGFR_L858R的陽性符合率為92.00%，符合率為98.56%，97.30%，Youden90.56%，KappaKappa=0.913>0.75在95%的置信區(qū)間內(nèi)，表明試劑和試劑檢測EGFR_L858R有較好的一致性。綜上所述，華大生物技術(shù)生產(chǎn)的人EGFR20種突變檢測九、附件附件一、對比試劑檢測EGFR突變陽性樣本各突變類型統(tǒng)計(jì)附件二、酶切法進(jìn)行第驗(yàn)證附件四、人EGFR20種突變檢測試劑盒臨床試驗(yàn)項(xiàng)目病例報(bào)告附件一、對比試劑檢測EGFR突變陽性樣本各突變類型統(tǒng)BaseAminoAcid檢測陽p.E746_A750del80p.E746_T7510300p.E746_A750del000p.L747_E7490p.L747_T7510p.L747_S75200050p.L747_T751006319del31例可確定具體突變型，32例附件二、酶切法進(jìn)行第驗(yàn)證一、酶切法進(jìn)行第驗(yàn)證采用臨床分子診斷金標(biāo)準(zhǔn)的CR作為作為第試劑，驗(yàn)證考核試劑與對比試劑檢測結(jié)果不一致樣本。同時(shí)，在CR.第一輪CR酶切：對捕獲出的目的區(qū)域進(jìn)行酶切反應(yīng)，消化野生型片段。第二輪PCR：進(jìn)行第二輪PCR富集反應(yīng)，富集目的區(qū)域，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)EGFR19del酶切限制性內(nèi)切酶MseI，可特異性識別TTAA位點(diǎn)。在第一輪PCR反應(yīng)后時(shí)，突變位點(diǎn)不能被內(nèi)切酶MseI識別；未發(fā)生缺失突變的TTAA可被MseI限制性內(nèi)切酶識別并酶切，從而使突變型得到富集[1,2,3,4]。引物設(shè)計(jì)（生工合成EGFR19del酶切限制性內(nèi)切酶MscI，可特異性識別TGGCCA位點(diǎn)。在第一輪PCR反應(yīng)后對產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化。L858R突變發(fā)生在TGGCCA位點(diǎn)(T>G)，當(dāng)發(fā)生突變時(shí)，突變位點(diǎn)不能被內(nèi)切酶MscI識別；未發(fā)生缺失突變的TGGCCA可被MscI內(nèi)切酶識別并酶切，從而使突變型得到富集[1,2,3,4]。引物設(shè)計(jì)（生工合成Exon21-三、酶切流1反應(yīng)組F0.2（10R0.2（10水人組3共PCR95℃95℃10s,55℃35s，20cycles；72℃5min；12forever2、酶反應(yīng)組215共酶切PCR37℃60min，65℃3反應(yīng)組F0.6（10R0.6（10水5共PCR95℃95℃10s,55℃35s，35-4012℃4、將二輪PCR的產(chǎn)物取5ul電泳剩余25ul送生工或英俊進(jìn)序5、結(jié)果判、成功樣本，根據(jù)峰圖是否出現(xiàn)突變峰判定結(jié)果CR1CR野生型存在被完全酶切情況如果樣本中無突變則可能被完全酶切導(dǎo)致失敗2樣本片段化嚴(yán)重有效DNA含量低存在CR抑制劑等導(dǎo)致CR擴(kuò)增失敗。參考文1YangF,ChenK,JiangG,LiJ,WangJ.ModifiedRestrictionEnzyme-basedDetectionofEGFRMutationsinLungCancer.ZhongguoFeiAiZaZhi2011Aug;14(8):637-41.