微生物藥物學(xué)抗菌肽

微生物藥物學(xué)抗菌肽第1頁/共40頁第六章

抗菌肽--抗菌藥物新資源

第一節(jié)抗菌肽類活性物質(zhì)的發(fā)展

第2頁/共40頁一、抗菌肽簡(jiǎn)介從微生物代謝產(chǎn)物中分離得到的一些多肽類抗生素很早已經(jīng)被應(yīng)用;但繼1980年在美國天蠶體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)動(dòng)物來源的抗生素多肽－殺菌肽（cecropin）以來，在昆蟲、兩棲類、水產(chǎn)動(dòng)物、包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物甚至植物及細(xì)菌等廣泛的生物譜中發(fā)現(xiàn)了至少1700余種抗菌肽;它們構(gòu)成了宿主抵抗外來病原菌感染的第一道防線。

第3頁/共40頁一、抗菌肽簡(jiǎn)介

抗菌肽是一類帶正電荷的兩親性小分子肽的總稱，通常含有11～50個(gè)氨基酸殘基。按抗菌肽來源分為:微生物抗菌肽;動(dòng)物抗菌肽;人源性抗菌肽;植物抗菌肽等。第4頁/共40頁一、抗菌肽簡(jiǎn)介其中動(dòng)物抗菌肽又分為:昆蟲抗菌肽;哺乳動(dòng)物抗菌肽;兩棲動(dòng)物抗菌肽3大類。根據(jù)抗菌肽作用對(duì)象的不同，又可以分為:抗細(xì)菌肽;抗真菌肽;抗腫瘤肽；既抗細(xì)菌又抗真菌的抗菌肽;

既抗腫瘤又抗微生物的抗菌肽等類型。第5頁/共40頁一、抗菌肽簡(jiǎn)介如此繁多的抗菌肽有其共同的特性，即微量抗菌譜廣（包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、寄生蟲），同時(shí)有抗某些帶包膜病毒的作用，甚至可殺傷腫瘤細(xì)胞，但且大多數(shù)抗菌肽對(duì)正常真核細(xì)胞無毒性或低毒性，且?guī)缀鯚o耐藥性。正因如此，抗菌肽亦被稱為"天然的抗生素"，因其有望克服日益嚴(yán)重的抗生素耐藥問題而引起了人們極大的興趣。

第6頁/共40頁一、抗菌肽簡(jiǎn)介對(duì)動(dòng)物來源的抗菌肽的研究發(fā)現(xiàn)它們中的大多數(shù)是生物預(yù)防微生物感染的天然防衛(wèi)系統(tǒng)的重要組成;在人和其它哺乳類中，這些多肽如防御素（defensins）是中性白細(xì)胞構(gòu)成中的主要蛋白類物質(zhì)（總共為10～18%），中性白細(xì)胞是對(duì)微生物侵襲和急性感染起著直接防衛(wèi)作用的最重要的細(xì)胞;其它細(xì)胞也能產(chǎn)生這些多肽;在受傷的黏膜表面包括舌、氣管、腸等發(fā)現(xiàn)有高濃度的多肽，這可能是一種重要的黏膜保護(hù)成分。

第7頁/共40頁一、抗菌肽簡(jiǎn)介當(dāng)科學(xué)家研究受傷的青蛙和蟾蜍為什么在惡劣的環(huán)境下不受感染的原因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了滑瓜蟾素（magainins）;滑瓜蟾素和昆蟲多肽如殺菌肽都由受傷后誘導(dǎo)產(chǎn)生，可以假定，這種誘導(dǎo)反應(yīng)與生物體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相似。

第8頁/共40頁二、陽離子多肽的基本結(jié)構(gòu)和功能陽離子多肽有兩個(gè)顯著的特征：一是根據(jù)組成多肽分子的精氨酸和賴氨酸的數(shù)量，這些多肽具有至少一個(gè)凈的二價(jià)正電荷，這些氨基酸在自然pH條件下都帶有正電荷；二是這些帶有正電荷的多肽能夠在與細(xì)菌質(zhì)膜發(fā)生作用時(shí)折疊成三維空間結(jié)構(gòu)，從而可以形成由一個(gè)非極性氨基酸側(cè)鏈組成的疏水面，和另外一個(gè)由極性氨基酸殘基和帶有正電荷氨基酸殘基組成的親水面;盡管這些陽離子多肽都具有這兩個(gè)面，但其在氨基酸組成、多少和與細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生作用后所形成的三維結(jié)構(gòu)上差距甚大。

第9頁/共40頁二、陽離子多肽的基本結(jié)構(gòu)和功能

根據(jù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的100多種陽離子多肽在細(xì)菌質(zhì)膜上形成的三維結(jié)構(gòu)可以將其分為4種類別：第一種為α-螺旋結(jié)構(gòu)：如cecropins（從昆蟲Hyalophoracecropia

中分離得到）和magainins(從非洲蛙Xenopuslaevis中分離得到)；第二種為由2至3個(gè)二硫鍵橋穩(wěn)定的β-片層結(jié)構(gòu)：如defensins（可來自于不同的動(dòng)物和植物）、protegrins（來自于豬）和tachyplesins（來自于蟹）等；第三種為含有一個(gè)或多個(gè)二硫鍵而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多肽：如bactenecin（來自于牛）；第四種為富含某種特殊氨基酸如脯氨酸/精氨酸的伸展螺旋：如牛多肽Bc5和Bac7，以及豬多肽PR-39等。第10頁/共40頁（a）：β-片層結(jié)構(gòu)的人源defensin-1；（b）：α-螺旋結(jié)構(gòu)的cecropin-melitlin雜合體；（c）：伸展螺旋的indolicidin；

（d）：環(huán)狀結(jié)構(gòu)的bactenecin第11頁/共40頁三、陽離子多肽的作用機(jī)制

目前，國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為細(xì)胞膜是抗菌肽的主要作用靶點(diǎn)，多肽通過肽－膜脂作用而在細(xì)胞膜上形成孔道:造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞;膜內(nèi)外電壓失衡;內(nèi)容物泄漏;最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

第12頁/共40頁帶有正電荷的多肽（1）與帶有負(fù)電荷的磷脂雙層外表面（細(xì)胞質(zhì)膜2）結(jié)合，導(dǎo)致局部的磷脂雙層變窄。在膜電位的影響下，多肽插入膜內(nèi)形成通道（3），導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)分子外流，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第13頁/共40頁陽離子多肽穿過革蘭陰性菌細(xì)胞外膜的自身促進(jìn)吸收作用帶有正電荷的多肽與結(jié)合在脂多糖上的二價(jià)陽離子產(chǎn)生交互作用，導(dǎo)致增強(qiáng)穿越細(xì)胞外膜的陽離子多肽的自身吸收。陽離子多肽在細(xì)胞外膜上產(chǎn)生的交互作用也能導(dǎo)致增加其它常用抗菌藥物的吸收，因而具有抗菌增強(qiáng)劑的作用。陽離子多肽與細(xì)胞外膜上脂多糖的結(jié)合可以用來解釋這些多肽具有抗內(nèi)毒素作用的原因。第14頁/共40頁三、陽離子多肽的作用機(jī)制

肽－膜脂作用的具體機(jī)制，觀點(diǎn)不一，較為經(jīng)典的有如下幾種模式：桶狀孔道模式（barrelstavemodel）;毯式模式（carpetmodel）;蟲蝕樣孔道模式（toroidal(wormhole)poremodel）。

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桶狀孔道模式和毯式模式

第16頁/共40頁4、選擇性殺傷機(jī)制

抗菌肽的選擇性殺傷機(jī)制一直是人們感興趣的熱點(diǎn)之一，有人認(rèn)為原核生物和真核生物細(xì)胞膜的脂質(zhì)特異性可以解釋這一點(diǎn)。第17頁/共40頁原核生物和真核生物細(xì)胞膜最主要的區(qū)別在于其脂質(zhì)的組成和排列：哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜外層脂質(zhì)為其所特有的呈電中性的兩性磷脂，主要是卵磷脂和鞘磷脂；而細(xì)菌細(xì)胞膜則含有大量的帶有負(fù)電荷的磷脂（如磷脂酰甘油和心磷脂），且有時(shí)其含量會(huì)超過50％，使其必然暴露于細(xì)胞外膜；此外，革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要由帶大量負(fù)電荷的脂多糖組成。第18頁/共40頁4、選擇性殺傷機(jī)制

抗菌肽可以選擇性的結(jié)合并滲透帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜，其動(dòng)力在于兩個(gè)方面：①膜與抗菌肽疏水端的疏水作用；②膜脂質(zhì)所帶的負(fù)電荷與抗菌肽所帶的正電荷間的靜電吸引作用。然而，起自身防御作用的抗菌肽的疏水性通常太弱以至不足以與兩性磷脂有效結(jié)合，從而防止了自身毒性。

原核生物和真核生物細(xì)胞膜另一重要的區(qū)別在于后者含有豐富的真核細(xì)胞特有的固醇類物質(zhì)，Matsuzaki等研究表明膽固醇的存在可以使人紅細(xì)胞免受滑瓜蟾素的破壞。腫瘤細(xì)胞等病變細(xì)胞膜脂質(zhì)成分或排列變化可能是導(dǎo)致抗菌肽對(duì)其殺傷的關(guān)鍵。第19頁/共40頁4、選擇性殺傷機(jī)制

總之，細(xì)胞膜的理化性質(zhì)決定了抗菌肽可以選擇性的廣譜殺菌而且可以防止耐藥的產(chǎn)生。首先，酶解和向細(xì)胞外排藥物等耐藥機(jī)制不存在于抗菌肽的抗菌過程；另外，抗菌肽的靶分子（陰離子脂質(zhì)）是廣泛存在于微生物界的重要的保守的細(xì)胞膜成份，所以，耐藥的產(chǎn)生尤其困難甚至幾乎不可能；也就是說，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞膜間最簡(jiǎn)單的電荷區(qū)別是抗菌肽選擇性殺傷、抗菌譜廣且對(duì)正常真核細(xì)胞幾乎無毒性或低毒性的關(guān)鍵所在。

第20頁/共40頁四、陽離子多肽的應(yīng)用

抗菌肽的發(fā)現(xiàn)不僅會(huì)推動(dòng)臨床抗菌藥物的應(yīng)用和對(duì)控制各種難以治療病原菌的感染起到重要的作用，同時(shí)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼抗菌肽的這些基因轉(zhuǎn)入到植物或動(dòng)物中，能夠起到防止病原菌感染的作用。抗菌肽因其獨(dú)特的抗菌機(jī)制在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及醫(yī)藥等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。第21頁/共40頁研究開發(fā)的公司名稱多肽適應(yīng)癥MagaininPharmaceuticalsMSI-78(α-螺旋)MSI-78膿皰病糖尿病足潰瘍表面感染AppliedMicrobiology/Astra/MerckNisin(lantibiotic)胃幽門桿菌感染/潰瘍AppliedMicrobiology/NipponShojiNisin突變體萬古霉素耐藥腸球菌MicrologixBiotechMBI-CNMBI-20系列（α-螺旋）革蘭陽性菌感染革蘭陰性菌感染、普通抗菌藥物的增效劑IntrabioticsIB367(β-片層)口腔黏膜炎（口腔潰瘍）XomaMycoprex(BPI衍生物)系統(tǒng)性念珠菌病、fluconazole增效劑

目前正在進(jìn)行臨床研究的一些陽離子多肽的適應(yīng)癥

第22頁/共40頁第二節(jié)防御素抗菌肽家族的研究進(jìn)展一、防御素的結(jié)構(gòu)特征哺乳動(dòng)物的抗菌肽主要有兩大類：防御素和cathelicidins。防御素為一族脊椎動(dòng)物來源的抗菌肽，其富含β-片層結(jié)構(gòu)及有一個(gè)由六個(gè)二硫鍵連接的半胱氨酸構(gòu)架，進(jìn)一步可分為α-和β-兩個(gè)亞族；在這兩種防御素都含有一個(gè)三重交鏈的β-片層結(jié)構(gòu)，其中帶有一個(gè)明顯的“防御素折疊”。

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Mitta等從2種貽貝（Mytilusedulis

、Mytilusgalloprovincialis）中分離到多種抗菌肽，根據(jù)抗菌肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)和半胱氨酸的不同分為4種：防御素(defensins)；貽貝素（mytilins）；貽貝肽（myticins）；貽貝霉素（mytimycins）；目前對(duì)貽貝素研究的比較透徹。

第24頁/共40頁二、防御素的分布早在20世紀(jì)60年代，當(dāng)人們研究豚鼠白細(xì)胞的抗菌活性時(shí)，就對(duì)多肽產(chǎn)生了興趣，因?yàn)樵诎准?xì)胞中富含這種物質(zhì)且具有廣譜抗菌的活性；當(dāng)人們?cè)谌税准?xì)胞中發(fā)現(xiàn)抗菌肽后，發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的分布很廣泛，其由上皮細(xì)胞產(chǎn)生并對(duì)宿主具有防御作用。在已經(jīng)研究過的哺乳動(dòng)物以及小雞和火雞中，都發(fā)現(xiàn)有典型的防御素多肽。從蛇毒也已分離到防御素類多肽（生長捕集多肽，growtharrestingpeptide和響尾蛇胺，crotamines），其可能作為一種上皮宿主防御多肽，以抵御更大的捕食者。第25頁/共40頁三、微生物對(duì)防御素的耐受性

通過插入誘變的方法，已經(jīng)鑒定了一些細(xì)菌對(duì)防御素產(chǎn)生耐受性的特異性機(jī)制。破壞phoP-phoQ雙組分轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，能夠增加沙門菌對(duì)防御素和其他陽離子多肽的敏感性。

第26頁/共40頁四、防御素的其他生物活性

防御素還具有許多其他生理活性，如對(duì)單核細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞的趨化活性（chemotacticactivity）；人源的β-防御素1和2，具有吸引記憶T-細(xì)胞和未成熟樹突細(xì)胞，這種化學(xué)吸引劑的作用可能是由于防御素與細(xì)胞因子受體CCR6結(jié)合的緣故。盡管這一生理學(xué)意義還沒有被了解，但在發(fā)炎的皮膚中高濃度的HBD-2（人源β-防御素2）使防御素有可能與天然的細(xì)胞因子配體競(jìng)爭(zhēng)。第27頁/共40頁四、防御素的其他生物活性

某些被稱之為皮質(zhì)激素抑制劑（corticostatins）的防御素，通過與促腎臟腺皮質(zhì)激素受體（adrenocorticotropichormone，ACTH）的非活化結(jié)合，達(dá)到相反的效果；盡管這種活性將抑制免疫抑制性激素可的松的產(chǎn)生，但對(duì)感染是有用的。另有報(bào)道稱某些防御素在納摩爾濃度下，對(duì)哺乳細(xì)胞具有活化硝苯吡啶敏感的鈣通道。也有報(bào)道稱某些與防御素遺傳和結(jié)構(gòu)相似的多肽，已經(jīng)在雄性生殖道，特別是副睪中發(fā)現(xiàn)。第28頁/共40頁第三節(jié)Cathelicidins抗菌肽家族

一、Cathelicidins基因組成和生物合成

20世紀(jì)90年代，在進(jìn)行bactenecin5cDNA的克隆時(shí)發(fā)現(xiàn)cathelicidins抗菌肽具有共同的結(jié)構(gòu)特征，即N末端都含有一個(gè)cathelin區(qū)域（一個(gè)來自豬白細(xì)胞的大小約12kDa的蛋白），所以在1995年將其命名為cathelicidins家族。研究證明cathelicidins基因有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。第29頁/共40頁二、Cathelicidins抗菌肽家族的結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)不同cathelicidins抗菌肽氨基酸的組成和在特定環(huán)境中的空間結(jié)構(gòu)特征，可將其分為4類，即α-螺旋、伸展螺旋、β-片層和環(huán)狀結(jié)構(gòu)抗菌肽。第30頁/共40頁（一）α－螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性α－螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌譜廣，既抗革蘭陽性菌，又抗革蘭陰性菌，還抗許多耐藥菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌、多重耐藥菌銅綠假單胞菌、大腸埃希菌包膜和非包膜菌株，以及肺炎克雷伯氏菌等。人LL-37的抗菌活性比人嗜中性白細(xì)胞肽1（一種α－防御肽）還強(qiáng)，可以抗銅綠假單胞菌和嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌等許多菌。

第31頁/共40頁（一）α－螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性帶有疏水性C末端的α-螺旋cathelicidins還具有抗真菌的活性；它們抗真菌的MIC值與抗細(xì)菌的相同或略高。α-螺旋cathelicidins抗菌肽以劑量依賴型方式，在MIC濃度時(shí)可迅速穿透敏感微生物的生物膜或人工膜，提高細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第32頁/共40頁（二）伸展螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性

Bac5和Bac7在體外有很強(qiáng)的抗菌活性，主要抗腸道革蘭陰性菌和一些革蘭陽性菌。在濃度為0.5～20μM時(shí)，能有效殺死大腸埃希菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、Enterococcuscloacae、表皮葡萄球菌和巨大芽孢桿菌。在相同濃度下，Bac7可抑制銅綠假單胞菌的生長。Bac5和Bac7均可抗螺旋體，如問號(hào)鉤端螺旋體和雙曲鉤端螺旋體，但伯氏疏螺旋體對(duì)它們耐藥。綿羊和山羊的Bac5同系物在低鹽濃度的介質(zhì)中表現(xiàn)出強(qiáng)大的廣譜的抗菌活性，可以抗革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和某些真菌。有關(guān)Bac5和Bac7的作用機(jī)制研究表明，在殺菌濃度下可以迅速抑制細(xì)菌細(xì)胞呼吸，從而殺死細(xì)菌。

第33頁/共40頁（二）伸展螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性Indolicidin還表現(xiàn)出直接的劑量依賴性和時(shí)間依賴性的殺病毒活性，可以抗人類免疫缺陷病毒(HIV-1)，此時(shí)它的抗病毒所需濃度比抗菌和抗真菌時(shí)高。Indolicidin可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜形成離散通道，從而使跨膜電位大大超過-70～-80mv，細(xì)胞內(nèi)容物向外流出而死亡。

第34頁/共40頁（三）環(huán)狀結(jié)構(gòu)的cathelicidins抗菌肽的抗菌活性

天然的環(huán)肽具有抗大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的活性，而合成的環(huán)肽可以抗革蘭陰性菌，卻不抗絕大多數(shù)的包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的革蘭陽性菌。綿羊OaDode也是如此。它在10-7～10-5M濃度下對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗菌活性，然而當(dāng)合成肽為環(huán)狀時(shí)，只抗革蘭陰性菌，不抗革蘭陽性菌。

第35頁/共40頁（三）環(huán)狀結(jié)構(gòu)的cathelicidins抗菌肽的抗菌活性

當(dāng)牛dodecapeptide環(huán)狀分子解環(huán)成線性分子后，它的抗菌活性就從抗革蘭陰性菌轉(zhuǎn)變到抗革蘭陽性菌。環(huán)狀dodecapeptide與LPS的結(jié)合更有效，更能提高外膜的滲透性，這就是環(huán)肽選擇性抗革蘭陰性菌的原因。環(huán)狀dodecapeptide對(duì)鼠和人T淋巴細(xì)胞，