外源基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞學(xué)方法和分子方法

外源基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞學(xué)方法和分子方法第1頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四首先可以通過引種解決本地區(qū)的蟲害、環(huán)境脅迫造成產(chǎn)量下降的問題。其次選擇抗性好的品種做親本，與農(nóng)藝性狀較好的親本雜交，選擇農(nóng)藝性狀和抗性均較好的后代推廣。（品種間雜交，雜種優(yōu)勢利用）遠(yuǎn)緣雜交（染色體工程）誘變育種生物技術(shù)育種：組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞融合技術(shù)，外源DNA導(dǎo)入等。小麥抗病蟲育種和抗環(huán)境脅迫育種的主要方法第2頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四要將野生親緣和潛在于更遠(yuǎn)緣物種的異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到栽培小麥中可以用兩種主要方法：細(xì)胞遺傳學(xué)操縱（染色體工程)

和分子技術(shù)（遺傳工程)。外源基因?qū)胄←湹膬煞N方法第3頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四

什么是染色體工程？

植物染色體工程的用途很廣,其中最重要的是基因定位和異源基因的導(dǎo)入。用導(dǎo)入異源基因改良現(xiàn)有小麥品種是小麥育種的重要方向之一。

通過染色體工程有效地轉(zhuǎn)移外源基因,并創(chuàng)造在育種中可利用的種質(zhì)材料,大致經(jīng)過以下步驟:種間或?qū)匍g雜交→F1或產(chǎn)生雙二倍體→異附加系→異代換系→易位系。其中異附加系、異代換系和易位系統(tǒng)稱為異染色體系,易位系的育種利用價值最高。第4頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四雙二倍體是染色體工程中的重要基礎(chǔ)材料,在其和小麥的回交后代中可以得到小麥的二體異附加系。二體異附加系是獲得代換系、端體附加系和易位系的基礎(chǔ),易位系是把帶有目的基因的異源染色體片段整合到小麥染色體上的材料。第5頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四整條染色體的細(xì)胞遺傳學(xué)操縱

附加系

細(xì)胞中添加異種染色體的系統(tǒng)稱異附加系。培育此添加系統(tǒng)的方法多種多樣,常規(guī)法、橋梁親本法、單倍體法、雙二倍回交法、雙重單體或多重單體附加法等均能創(chuàng)造異附加系。其中,最常用的方法是獲得栽培物種與親緣物種間的雜種F1后,用受體品種與F1或由F1加倍成的雙倍體回交一至數(shù)次,從回交后代中選擇添加單體再經(jīng)自交產(chǎn)生添加二體。第6頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四普通小麥（AABBDD）

X

簇毛麥（VV）2n=6x=42=21IIw 2n=2x=14=7IIv F1(ABDV)X普通小麥（AABBDD）

2n=4x=28=21Iw+7Iv2n=6x=42=21IIw

回交，自交

BCnFn

細(xì)胞學(xué)鑒定

21IIw+1II1v~7v雜交回交法第7頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四普通小麥（AABBDD）

X

黑麥（RR）

2n=4x=42=21IIw

2n=2x=14=7IIR F1(ABDR)2n=4x=28=21Iw+7IR

不減數(shù)配子染色體加倍 雙二倍體X普通小麥

（AABBDDRR）（AABBDD）

AABBDDRX普通小麥AABBDD

回交，自交

21IIw+1II1R~7RBCnFn

細(xì)胞學(xué)鑒定雙二倍體回交法第8頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四圓錐小麥（AABB）

X

簇毛麥（VV）2n=4x=28=14IIw

2n=2x=14=7IIv F1(ABV)2n=3x=31=14Iw+7Iv

不減數(shù)配子染色體加倍 雙二倍體X普通小麥

（AABBVV）（AABBDD）

AABBDVX普通小麥AABBDD

回交，自交

21IIw+1II1v~7vBCnFn

細(xì)胞學(xué)鑒定橋梁親本法第9頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四單倍體法單倍體法有兩種，一種是花藥培養(yǎng)法，另一種是染色體消失法。他們通過培養(yǎng)普通小麥與六倍體小黑麥、八倍體小偃麥的雜種Ｆ1花藥，獲得了各種單倍體異附加系，加倍后從中選出了小麥雙體異附加系。

Barclay（1975）報道了小麥分別與球莖大麥和玉米雜交，其后代中外源染色體自然消失的現(xiàn)象，并高頻率地獲得了小麥單倍體。李平路等（1998）首次將小麥×玉米法應(yīng)用于小麥異附加系的選育中，用煙農(nóng)15-八倍體小濱麥、煙農(nóng)15-中間偃麥草的雜種后代分別與玉米雜交，成功地獲得了小麥-濱麥和小麥-中間偃麥草的單倍體異附加株。

第10頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四

某種植物的一對染色體被他種植物的一對染色體所代換而形成的新類型稱異代換系。

培育異代換系的方法也有不同幾種,主要是利用單體或缺體與異附加系雜交進(jìn)行。代換系第11頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四遠(yuǎn)緣雜種連續(xù)回交普通小麥（AABBDD）

X

黑麥（RR）2n=6x=42=21IIw 2n=2x=14=7IIR F1(ABDR)X普通小麥（AABBDD）

2n=4x=28=21Iw+7IR2n=6x=42=21IIw

回交，自交

BCnFn

細(xì)胞學(xué)鑒定

AABBDD-1A1A+1R1R……AABBDD-7D7D+7R7R第12頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四

單體1AX二體附加系(1R)2n=41=21IIw-1II1A+1I1A2n=44=21IIw+1II1R

F1(2n=42=21IIw-1I1A+1I1R)(2n=43=21IIw+1I1R,2n=42=21IIw-1I1A+1I1R)

選擇2n=42的個體自交

2n=42=21IIw-1II1A+1II1R單體與附加二體雜交第13頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四缺體4DX小偃麥八倍體2n=41=21IIw-1II4D2n=56=21IIw+7IIE

F1X缺體4D

(2n=48=20IIw+7IE+1I4D)2n=41=21IIw-1II4D

BC1F1細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)篩選

2n=41=21IIw-1I4D+1I4E

自交

2n=42=21IIw-1II4D+1II4E缺體回交法第14頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四異附加系和異代換系的鑒定1）染色體計數(shù)和染色體構(gòu)型分析2）染色體分帶：C-帶，N-帶3）生化標(biāo)記:同工酶，蛋白質(zhì)4）分子標(biāo)記:RFLP,RAPD…5）DNA分子原位雜交：GISH，F(xiàn)ISH6）形態(tài)標(biāo)記第15頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四易位系通過附加或代換異源染色體可以將有益基因引入栽培植物中,但引入的染色體除攜帶有益基因外,亦帶有不利基因。如能使異源染色體上攜帶的有益基因通過易位整合到栽培植物的染色體上,就可以減少或消除不利基因的作用。這就需要建立易位系。所謂的易位系是指異源染色體與栽培植物染色體之間相互易位的植物。在易位系中,通過染色體易位達(dá)到了異源目的基因的轉(zhuǎn)移,這便是建立易位系的動機(jī)所在。第16頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四遠(yuǎn)緣雜交中經(jīng)常有自發(fā)易位產(chǎn)生,但異種、屬間的染色體自然發(fā)生易位的頻率很低。實(shí)踐中,易位系的建立就需人工誘發(fā)易位,一般是用電離射線照射或化學(xué)誘變劑處理。輻射能使染色體隨機(jī)斷裂,斷片常以各種不同方式進(jìn)行重接,產(chǎn)生各種染色體結(jié)構(gòu)變異,導(dǎo)致易位。小麥易位系的創(chuàng)建方法便是對攜有目標(biāo)基因的單體異附加系進(jìn)行輻射處理,以這種基因的表型性狀為標(biāo)記,在后代中選擇帶有這種基因而染色體數(shù)目仍為2n=42的個體。因為目的基因已轉(zhuǎn)移到小麥染色體上,這樣的個體就是易位系。第17頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四易位系的鑒定易位系一般來說不發(fā)生染色體數(shù)目的變化,因而它的鑒定要比鑒定異附加系和異代換系困難得多。常規(guī)的染色體計數(shù)以及染色體帶型分析效果不佳,特別是對不顯帶區(qū)段和小片段易位更是無能為力。目前,一般采用同工酶分析或分子原位雜交技術(shù)對易位染色體進(jìn)行標(biāo)定。第18頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四植物外源DNA的導(dǎo)入方法

外源DNA的導(dǎo)入是指通過某種特定的途徑將外源基因或外源DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之整合到受體細(xì)胞基因組中，而實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)的過程。第19頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四目前已經(jīng)建立了十多種外源DNA導(dǎo)入方法，按照技術(shù)屬性可將它們分為物理法、化學(xué)法、生物法：1、物理法：基因槍法、電激法、微注射法、激光穿刺法、超聲波法、碳化硅纖維法等；2、化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸鈣－DNA共沉淀、脂質(zhì)體法等；3、生物法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、浸漬法、病毒介導(dǎo)法等。第20頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四一、原理農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，它們侵染植物后能誘發(fā)植物形成腫瘤。從一種致癌的農(nóng)桿菌中分離出了一種巨大質(zhì)粒（約200Kb），稱為致癌質(zhì)粒，簡稱Ti質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒上有一段DNA被稱為轉(zhuǎn)移DNA（簡稱T－DNA），能轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上，其上攜帶的基因能在受體細(xì)胞中表達(dá)。Ti質(zhì)粒隨后被改造用作人工植物基因工程的載體。這種利用農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將外源目的基因或DNA片段插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中，并隨之導(dǎo)入受體植物細(xì)胞，而獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，即為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。

第一節(jié)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法第21頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四Ti質(zhì)粒的必需組成元件，包括T－DNA區(qū)域和致毒基因(Virgene)TDNA是Ti質(zhì)粒中唯一能夠與植物染色體整合的序列，而致病區(qū)中的一系列基因則起著輔助整合的作用。與冠癭堿生成有關(guān)的是Vir區(qū)和T-DNA區(qū)，植物體內(nèi)不能合成冠癭堿，冠癭堿的合成為農(nóng)桿菌的生長提供了必要的碳源和氮源。第22頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)

基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法、粒子轟擊法、高速粒子噴射技術(shù)、彈道微靶點(diǎn)射擊，是一種借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。第23頁，共25頁，2023年，2月20日，星期四