基因工程與分子生物學(xué)常用技術(shù)

基因工程與分子生物學(xué)常用技術(shù)第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)基因工程與基因重組

(GeneticEngineeringandGeneticrecombination)

一、基因工程的基本概念

不同來源的DNA分子可以通過磷酸二酯鍵連接形成重新組合的DNA分子，稱為DNA重組。

將基因進行克隆，并表達制備特定的產(chǎn)物，或定向改造細胞乃至生物個體的特性所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(一)工具酶1.限制性核酸內(nèi)切酶

(1)能夠切割DNA中磷酸二酯鍵的酶稱核酸酶，其中有選擇地切割DNA分子特異序列的核酸酶，稱為限制性核酸內(nèi)切酶，簡稱限制性內(nèi)切酶。(2)命名HindⅢ

屬

系

株

序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶(3)識別特征5′???GAATTC???3′3′???CTTAAG???5′

限制性內(nèi)切酶識別的DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征。第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四

不同的限制性內(nèi)切酶識別和切割的特異性不同，結(jié)果有3種不同的情況：①產(chǎn)生3′突出粘性末端：以EcoRⅠ為例：5′???G↓AATTC???3′5′???GAATTC???3′3′???CTTAA↑G???5′3′???CTTAAG???5′

②產(chǎn)生5′突出粘性末端：以PstⅠ為例：5′???CTGCA↓G???3′5′???CTGCAG???3′3′???G↑ACGTC???5′3′???GACGTC???5′

③產(chǎn)生平末端：NruⅠ為例：5′???TCG↓CGA???3′5′???TCGCGA???3′3′???AGC↑GCT???5′3′???AGCGCT???5′(4)切割位點第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四2.DNA聚合酶(1)基因工程主要應(yīng)用E.coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶等。(2)主要用途：①利用5/→3/聚合活性，合成DNA第二條鏈；②對DNA的3/端進行填補或末端標記；③E.coliDNA-polⅠ用于缺口平移，制作探針；④T4DNA聚合酶可用于DNA序列測定；⑤TaqDNA聚合酶用于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。3.DNA連接酶

使單鏈切口形成磷酸二酯鍵，共價地連接。第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四4.逆轉(zhuǎn)錄酶(1)用于真核mRNA逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫。(2)用于進行3/端填補和標記，制備DNA探針。(3)用于DNA序列測定。

5.多核苷酸激酶

(1)用于放射性標記DNA鏈的5/端。

(2)用于缺少5/-磷酸基的DNA磷酸化。6.堿性磷酸酶此酶防止載體的自身連接。7.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化單核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA的3/-端羥基上。第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(二)載體1.為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子，稱為載體。2.載體的選擇標準能自主復(fù)制。易進入宿主細胞。具有多克隆位點。易從宿主細胞中分離純化。有易被識別和篩選的標志。質(zhì)粒噬菌體粘粒病毒3.常用載體第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四①質(zhì)粒是細菌中獨立于染色質(zhì)以外的、能自主復(fù)制的、并與細菌或細胞共存的遺傳成分，可賦予宿主細胞某些遺傳性狀。②通常質(zhì)粒的大小為2～300kb。③一般只能容納10kb的外源DNA片斷。(1)質(zhì)粒(plasmid)第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(2)噬菌體(bacteriophage，phage)①噬菌體是感染細菌的一類病毒，因其寄生在細菌中并能溶解細菌細胞，故稱為噬菌體。

②噬菌體由頭和尾構(gòu)成，感染時尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。③具有溶菌性和溶原性兩種不同的繁殖方式。

第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(3)粘粒(cosmid)②粘粒本身約4～6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因組文庫的載體。①粘粒是將λ噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒組合的裝配型載體。(4)病毒

病毒載體更多地用于真核表達系統(tǒng)，如腺病毒、痘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和猴空泡病毒。第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四二、重組DNA技術(shù)的基本原理和過程

基因工程中最主要是分子克隆，克隆是指由一個細胞經(jīng)過無性繁殖后所形成的子代群體。進行分子克隆所采用的技術(shù)即重組DNA技術(shù)，故又稱為分子克隆技術(shù)或基因工程技術(shù)。

制備目的基因和相關(guān)載體；將目的基因和載體進行連接；將重組的DNA導(dǎo)入受體細胞；

DNA重組體的篩選和鑒定；

DNA重組體的擴增、表達。

基本步驟第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(一)目的基因的制備1.制備基因組DNA文庫

(genomiclibrary)

將基因組DNA酶切成片段，再與載體分子拼接成重組DNA，將其引入宿主細胞進行擴增，所得分子克隆混合體稱基因組文庫。2.制備cDNA文庫

(cDNAlibrary)

將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再與載體連接成重組DNA，將其引入宿主細胞并進行擴增，所得分子克隆的混合體稱為cDNA文庫。第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四3.聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)

如已知目的基因序列，則可采用PCR從基因組DNA中獲得目的基因，也可以采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)直接從mRNA獲得特定基因的cDNA。4．化學(xué)合成

如已知肽鏈的氨基酸順序，則可按對應(yīng)密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列，然后合成該段DNA序列。第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(二)目的基因與載體的連接1．粘性末端連接2．同聚物加尾連接3．平末端連接4．人工接頭連接

將目的基因插入載體，用DNA連接酶連接雙鏈DNA粘性末端序列，在體外重新連接成人工重組體。方法主要有以下四種：第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(三)將外源DNA導(dǎo)入宿主細胞常用的方法有以下兩種：1.轉(zhuǎn)化(transformation)

轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。2.感染(infection)

感染是指以噬菌體進入宿主菌或病毒進入宿主細胞中繁殖的過程。第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四1.遺傳學(xué)方法針對載體攜帶有某些標志基因如抗藥性標志基因(ampr、tetr、kanr等)和目的基因而設(shè)計的篩選方法。2.分子雜交方法

利用32P標記的探針與重組DNA或克隆DNA片段進行分子雜交，直接篩選并鑒定目的基因。3.免疫學(xué)方法利用特異性抗體與目的基因表達產(chǎn)物特異結(jié)合的方法篩選。(四)目的基因的篩選和鑒定第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(五)克隆基因的表達

利用重組DNA技術(shù)所獲得目的基因或DNA序列，可實現(xiàn)在受體細胞中的表達，即產(chǎn)生mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。(六)重組DNA技術(shù)操作過程總結(jié)歸納

分切接轉(zhuǎn)篩分離目的基因限制酶切目的基因與載體拼接重組體轉(zhuǎn)入受體菌篩選重組體第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四2.特點針對性強、特異性強、靈敏度高、適應(yīng)性強。三、基因診斷和基因治療1.基因診斷是指利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。(一)基因診斷(genediagnosis)

3.應(yīng)用遺傳性疾病腫瘤感染性疾病遺傳易感性疾病器官移植配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四1.基因治療是指以正?；虺C正、替代缺陷基因，或從基因水平調(diào)控細胞中缺陷基因表達的一種治療疾病的方法。2.

狹義的基因治療是指將目的基因?qū)氚屑毎?，與宿主細胞的基因整合后表達以達到治療疾病的方法。3.

廣義的基因治療是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用以達到治療疾病的方法。

(二)基因治療(genetherapy)第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四5.基因治療的基本程序(1)選擇和制備目的基因：治療性基因。(2)選擇基因轉(zhuǎn)運載體：通常選擇病毒載體。(3)選擇靶細胞：體細胞、生殖細胞。(4)轉(zhuǎn)移基因：將治療基因?qū)氩⒈磉_。4.基因治療的基本策略基因增補基因置換基因矯正基因失活基因疫苗第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(TheTechnologyandApplicationinMolecularBiology)第二節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用

核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)是指利用DNA復(fù)性原理，把不同來源的DNA單鏈或DNA與RNA混合，如單鏈分子間有堿基配對關(guān)系，則可形成雜化雙鏈的過程。一、核酸分子雜交技術(shù)第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(一)探針(probe)2.理想探針的特點

(1)帶有標記的示蹤物，便于檢測、鑒定；

(2)應(yīng)是單鏈；

(3)具有高度特異性；

(4)探針長度一般為數(shù)十至數(shù)千個堿基;(5)具有高靈敏度和穩(wěn)定性，標記方法簡便安全。1.

探針是一段與被測的核苷酸序列(靶基因序列)互補的帶有標記的核苷酸片段。第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(二)核酸分子雜交的基本方法Southern印跡雜交

(1)指將經(jīng)酶切和電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)印到固相支持物上，然后與標記的DNA探針雜交。

(2)可用于分子克隆、遺傳病診斷、法醫(yī)鑒定、腫瘤研究和器官移植等方面。2.Northern印跡雜交

(1)指將經(jīng)電泳分離后的待測RNA片段轉(zhuǎn)印到固相支持物上，然后與標記的核酸探針進行雜交。

(2)主要用于檢測各種基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，主要是mRNA。第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四3.斑點及狹縫印跡雜交

(1)指將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再與探針雜交，稱為斑點印跡。若采用狹縫點樣器加樣后雜交，其印跡為線狀，稱為狹縫印跡雜交。

(2)主要用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量研究。4.原位雜交

(1)指將標記的核酸探針與經(jīng)適當(dāng)方法處理的細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。

(2)該方法不需從組織或細胞中提取核酸，有很高的靈敏度，并可保持組織與細胞的形態(tài)，更能準確地反映出組織細胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四二、聚合酶鏈反應(yīng)(一)PCR的基本原理1.PCR有三個反應(yīng)步驟DNA的變性DNA與引物的退火(復(fù)性)引物的延伸。第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四n個循環(huán)加熱變性模板DNA退火DNA延伸P25′

3′5′

3′5′

3′

3′P15′2.變性→復(fù)性→延伸這三個步驟為一個循環(huán)，每次循環(huán)的產(chǎn)物作為下個循環(huán)的模板，如此循環(huán)多次，則DNA成指數(shù)擴增。第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四PCR反應(yīng)體系：

1.引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，取決于引物與模板DNA互補的程度。

2.酶濃度酶催化的PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶量約需2.5U。