基因工程第二章 基因工程的工具酶

第一節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶（RestrictionEndonuclease）能專一性識別雙鏈DNA上的特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開。來源：細菌、霉菌和藍藻功能：細胞內(nèi)限制性修飾系統(tǒng)的一部分，可以降解“入侵”的外源DNA現(xiàn)在是1頁\一共有52頁\編輯于星期三限制性內(nèi)切酶作為細菌體內(nèi)保護自身、避免被噬菌體入侵的作用機制。現(xiàn)在是2頁\一共有52頁\編輯于星期三一、限制性內(nèi)切酶的命名和種類1.命名：生物的屬名的第一個字母和種名的第一、二個字母命名，菌株的代號的一個字母，和羅馬數(shù)字表示?，F(xiàn)在是3頁\一共有52頁\編輯于星期三EcoRIEscherichia屬名Coli種類Ry13株系編號第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株名；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序?，F(xiàn)在是4頁\一共有52頁\編輯于星期三2.限制性內(nèi)切酶的種類：平端5′突出粘端3′突出粘端現(xiàn)在是5頁\一共有52頁\編輯于星期三識別序列：在雙鏈DNA分子能夠識別的特殊核苷酸序列;一般為4-8bp1）二重旋轉(zhuǎn)對稱識別序列（回文序列）現(xiàn)在是6頁\一共有52頁\編輯于星期三3.限制酶的特點

1).識別順序和酶切位點

①識別４-8個相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外側(cè)，產(chǎn)生５’-端突起２）富含ＧＣ現(xiàn)在是7頁\一共有52頁\編輯于星期三

３）對稱性—雙對稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外

５）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

2).

末端種類

１）３’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

EcoRI

5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’現(xiàn)在是8頁\一共有52頁\編輯于星期三３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補的粘性末端ａ）切點在識別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

現(xiàn)在是9頁\一共有52頁\編輯于星期三５）相容性末端如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN

上述幾種限制酶產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識別和酶切，但BamHI和BglII的識別機率只有1/16。

BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/A

BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識別和酶切。

BamHI+BglIIA/GGATCT/C

不同末端的連接特性:除第4種末端不能進行不同DNA分子或同種DNA分子不同切點產(chǎn)生的末端相連外，其余4種末端可以相互連接。現(xiàn)在是10頁\一共有52頁\編輯于星期三4.同尾酶(Isocaudamer)有些來源不同的限制酶，識別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端。MunI：5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新連接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`兩種同裂酶切割形成的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序列，能否被原來的限制酶所識別和切割？現(xiàn)在是11頁\一共有52頁\編輯于星期三5.異源同序酶（Isoschizomer，同裂酶）

1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶

2.特點：1）識別相同順序

2）切割位點的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

6.限制酶的星反應(yīng)（Staractivity）

1.

特點:限制酶識別序列特異性降低

2.

發(fā)生星反應(yīng)的限制酶和條件（見下頁）

3.

星反應(yīng)的利用和避免現(xiàn)在是12頁\一共有52頁\編輯于星期三表1具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識別序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；

5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亞砜(8%);8:無NaCl。

現(xiàn)在是13頁\一共有52頁\編輯于星期三3.限制性內(nèi)切酶作為基因工程常用工具酶的機制：現(xiàn)在是14頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是15頁\一共有52頁\編輯于星期三3.定向克隆的機制：現(xiàn)在是16頁\一共有52頁\編輯于星期三4.利用噬菌體克隆大片段DNA的機制：現(xiàn)在是17頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是18頁\一共有52頁\編輯于星期三5.重組DNA片段的檢測：1）抗藥性篩選現(xiàn)在是19頁\一共有52頁\編輯于星期三2）顯色性篩選現(xiàn)在是20頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是21頁\一共有52頁\編輯于星期三1.底物DNA：DNA的純度、分子構(gòu)型、識別序列的側(cè)面序列、位點的偏愛和DNA甲基化有關(guān)系。2.限制性內(nèi)切酶的用量：酶的活性單位：（U/μl）3.反應(yīng)體系：20μl

DNA：3.0μl（1.0μg）

10XBuffer：2.0μl

Enzyme：0.5μl

ddH2O：14.5μl二、限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)體系現(xiàn)在是22頁\一共有52頁\編輯于星期三4.雙酶切法：DNA：3.0μl（1.0μg）

10XBuffer：2.0μl

Enzyme1：0.5μl

Enzyme2：0.5μl

ddH2O：14.0μl5.雙酶切注意事項：1）兩個酶通用緩沖液中的活力；2）用量的控制；現(xiàn)在是23頁\一共有52頁\編輯于星期三6.具體操作時應(yīng)注意事項：①整個操作應(yīng)在0℃進行，即在冰浴中進行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。②當切割大量DNA時，通常采用延長反應(yīng)時間，減少酶的用量。③當DNA需2種或以上酶切時，應(yīng)用通用緩沖液，若沒有通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進行下一個酶切反應(yīng)。

現(xiàn)在是24頁\一共有52頁\編輯于星期三限制酶在各種緩沖液中的相對活性

現(xiàn)在是25頁\一共有52頁\編輯于星期三DoubleDigestion(雙酶切反應(yīng))時UniversalBuffer(通用緩沖液)的使用表

現(xiàn)在是26頁\一共有52頁\編輯于星期三7.對酶切結(jié)果進行分析

通過限制性酶切可以得到一定數(shù)量的DNA片斷，DNA帶負電荷，因此，當DNA分子被置于電場中時它們就會向陽極遷移。這樣就可以通過凝膠電泳對酶切DNA片段進行分離?，F(xiàn)在是27頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是28頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是29頁\一共有52頁\編輯于星期三內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。

完全消化（CompleteDigestion）

12341234現(xiàn)在是30頁\一共有52頁\編輯于星期三只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。

局部消化

123414部分酶切（PartDigestion）現(xiàn)在是31頁\一共有52頁\編輯于星期三第二節(jié)DNA連接酶（DNALigase）

1967年，世界上數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)該酶。2.1基本性質(zhì)：能將兩段DNA拼接起來的酶，催化DNA相鄰的5‘磷酸基團和3’羥基末斷之間形成磷酸二酯鍵，封閉DNA單鏈缺口?，F(xiàn)在是32頁\一共有52頁\編輯于星期三2.2T4DNA連接酶的作用機制：①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，釋放出酶。③活化的5’磷酸根與相鄰的3’羥基形成3’,5’-磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。

現(xiàn)在是33頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是34頁\一共有52頁\編輯于星期三

8.1.3兩種DNA連接酶比較

T4DNAligaseE.coliDNAligase來源T4

噬菌體大腸桿菌分子量68kD75kD輔助因子ATPNAD+底物1)雙鏈DNA分子的粘、平端1)同源互補粘端

2)RNA-DNA雜合體、RNA鏈缺口2)雙鏈分子中的單鏈缺口

3)雙鏈DNA分子中的單鏈缺口應(yīng)用范圍廣泛.效率高窄現(xiàn)在是35頁\一共有52頁\編輯于星期三修復雙鏈DNA缺口處的磷酸二酯鍵現(xiàn)在是36頁\一共有52頁\編輯于星期三修復與RNA結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵現(xiàn)在是37頁\一共有52頁\編輯于星期三連接多個平頭雙鏈DNA分子：現(xiàn)在是38頁\一共有52頁\編輯于星期三注意：DNA連接酶不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的必須是雙螺旋DNA分子的一部分?，F(xiàn)在是39頁\一共有52頁\編輯于星期三2.3DNA片段之間的連接2.3.1具互補黏性末端片段之間的連接基本原理：用DNA連接酶連接具有互補粘性末端DNA片段。現(xiàn)在是40頁\一共有52頁\編輯于星期三2.4具平末端DNA片段之間的連接基本原理：直接用T4DNA連接酶連接.現(xiàn)在是41頁\一共有52頁\編輯于星期三2.5DNA片段末端修飾后進行連接1)DNA末端同聚物加尾后進行連接基本原理：利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能在DNA的末端加尾?，F(xiàn)在是42頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是43頁\一共有52頁\編輯于星期三2)黏性末端修飾成互補粘端或平末端后進行連接基本原理：

采用兩種方法①修平：用核酸酶切除雙鏈DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4連接酶作平末端連接。②補平：用Klenow酶將粘端補平，產(chǎn)生平末端或匹配粘端，再用T4連接酶進行連接。現(xiàn)在是44頁\一共有52頁\編輯于星期三現(xiàn)在是45頁\一共有52頁\編輯于星期三

HindIII↓

↓XbaI5’----ACTAGA----3’

3’----TTCGA

T----5’ dATP dTTPKlenowdGTPdCTPKlenow5’----AAG

CTAGA----3’3’----TTCGA

TCT----5’

T4DNAligase

5’----AAGCTAGA----3’3’----TTCGATCT----5’

圖HindIII,XbaI酶切粘端的補平和連接現(xiàn)在是46頁\一共有52頁