微生物實驗器材與基本操作

微生物實驗器材與基本操作第1頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四內容實驗室的基本設備培養(yǎng)器皿準備培養(yǎng)基的制備滅菌與消毒微生物的無菌操作與檢查第2頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四實驗室的基本設備玻璃試管

管壁必須較厚，沒有翻口接種工具第3頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)皿的準備（一）清洗

(清潔的玻璃器皿是得到正確實驗結果的重要條件之一）目的：除污垢（灰塵、油污、無機鹽）洗滌劑：洗衣粉

洗潔精

第4頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四玻璃儀器的清洗新購買的玻璃器皿的清洗（表面附有游離的堿性物質）比色皿的清洗

不可用強堿，也不可用超聲清洗用洗液浸泡，再用自來水沖洗，應內外不掛水珠第5頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四使用過的玻璃器皿的清洗一般玻璃器皿染菌的玻璃器皿121℃高壓蒸汽滅菌，20~30min染菌的移液管

使用后立即放入5%石炭酸溶液中浸泡數(shù)小時第6頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四塑料器皿的清洗硅膠塞：新購置的硅膠塞帶有帶量的滑石粉，用自來

水沖洗，再用2%NaOH溶液煮10~20min。再

用自來水沖洗，然后再用5%鹽酸溶液浸泡

30min，最后再用自來水沖洗。第7頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿用玻璃棒將瓊脂培養(yǎng)基刮下瓊脂培養(yǎng)基已干燥

將器皿放入少量的水中煮沸，使瓊脂熔化后趁熱倒出第8頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四洗滌后培養(yǎng)皿的放置第9頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四（二）包扎（1）培養(yǎng)皿的包扎

洗凈晾干后的培養(yǎng)皿，用舊報紙包扎，每包6—10套。（2）吸管的包扎第10頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四（3）試管的包扎

塞上合適的試管塞（塞子的1/2~1/3進入試管），然

后7—10支一捆用報紙包扎，滅菌。（4）試劑瓶的包扎

用報紙或牛皮紙包扎后，滅菌。

（5）三角瓶的包扎

塞上合適的試管的塞，或蓋上8層紗布，外加一層報

紙，用棉繩包扎后滅菌。

（6）吸頭和Eppendorf管

吸頭根據(jù)不同的規(guī)格戴手套加入不同的盒子；Ed管放入飯盒中，滅菌，50°烘干后備用。第11頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基的制備按物理狀態(tài)分：液體培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基

1.5%—2%凝固劑

半固體培養(yǎng)基

少量凝固劑（0.2%—0.7%）

第12頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四常用培養(yǎng)基成分一般細菌

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：

第13頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四真菌

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：第14頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四放線菌

高氏1號培養(yǎng)基：第15頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四霉菌查氏培養(yǎng)基：第16頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四酵母菌

（1）PDA

（2）麥芽汁培養(yǎng)基

（3）豆汁葡萄糖培養(yǎng)基

（4）YPD培養(yǎng)基

1%YeastExtract（酵母膏）2%Peptone（蛋白胨）2%Dextrose(glucose)（葡萄糖）若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉第17頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四（一）液體培養(yǎng)基的配制1、稱量2、溶解加水至總容積的4/5左右，慢慢攪拌使其溶解。

如有需要，可加熱。3、調PH培養(yǎng)基溶解均勻并冷卻至室溫用PH試紙測PH，

用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液調節(jié)PH。（緩

慢少量多加攪拌）再加水到所需的量。4、分裝分裝于三角瓶時，分裝量不得超過容積的1/2。5、封口瓶口處蓋上6~8層紗布，瓶口布外包一層牛皮

紙或兩層報紙，用棉繩捆綁。6、滅菌做好標記，放入高壓滅菌鍋中120℃，20min7、冷卻后接種第18頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四（二）平板培養(yǎng)基的配制1、稱量按比例稱取一定量的瓊脂粉（1.5%—2%），

放入三角瓶中。2、按液體培養(yǎng)基的配制1~3步操作，調好PH，定容3、分裝分裝量不得超過三角瓶的1/24、封口6~8層紗布，再外包一層牛皮紙或兩層報紙5、滅菌做好標記，高壓滅菌鍋中120℃，20min6、冷卻放入55℃烘箱或水浴中，溫度降至55℃，進

入無菌室倒平板。第19頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四7、倒平板在超凈臺的酒精燈火焰旁的無菌區(qū)內進行操作，右手那裝有培養(yǎng)基的三角瓶，拔出試管塞；左手將培養(yǎng)皿的蓋在酒精燈火焰旁打開一條縫，讓三角瓶口深入；倒入培養(yǎng)基，蓋好后順著超凈臺邊緣將平板推入，平放在超凈臺上。8、倒置

冷卻至培養(yǎng)基凝固后，倒置平板，裝入保鮮袋中扎好，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?0頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四（三）斜面培養(yǎng)基的配制1、按液體培養(yǎng)基配制1~3步操作，調好PH，定容2、稱量

稱取1.5%~2%的瓊脂粉，加入已溶解的藥品中，再熔

化

瓊脂（控制火力，防止培養(yǎng)基溢出，不斷攪拌），

最后補足所失的水分。3、分裝

趁熱分裝于試管內，分裝量不超過高度的1/5~1/4，不

要污染試管塞。4、滅菌

加試管塞，7支成一捆，試管塞外包一層牛皮紙，或兩

層報紙，貼上標簽。高壓蒸汽鍋中121℃，20min。第21頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四5、擺斜面

溫度降至55℃左右，將滅菌后的斜面培養(yǎng)基，趁熱放于玻璃棒或移液管上，調整斜度，培養(yǎng)基的斜面不超過試管長度的1/2。6、保存

冷卻后，裝入保鮮袋中扎好，置于4℃冰箱中。第22頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四（四）半固體培養(yǎng)基的配制1、稱量

稱取0.7%左右的瓊脂粉2、同固體培養(yǎng)基相同第23頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四（五）無菌水的準備1、100ml三角瓶（裝有玻璃珠），裝雙蒸水45ml2、試管裝4.5ml雙蒸水3、塞上管塞或蓋上塑料蓋子4、包扎、滅菌5、備用第24頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四注意事項1、藥匙不要混用2、PH：(1)調PH要逐步滴加，勿使過酸過堿，破壞培養(yǎng)

基中的某些成分，防止回調或反復調整PH。

（2）滅菌后PH會發(fā)生改變，要注意檢測滅菌后的PH狀況。（較特殊的用于確定最適PH，最值PH）3、瓊脂：待液體培養(yǎng)基煮沸后，再加入瓊脂。4、分裝：避免培養(yǎng)基粘到管口或瓶口，如不小心粘上，

應立即擦干凈。5、制斜面和平板的培養(yǎng)基：溫度不宜太高，一般60℃左右。第25頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四6、試管塞：1/2~2/3進入試管內。7、液體培養(yǎng)：三角瓶內的培養(yǎng)基量一般為1/5~1/3,不應

超過容積的1/2。8、斜面培養(yǎng)：培養(yǎng)基裝量為試管高度的1/5~1/4，滅菌

后制成的斜面長度不超過1/2。9、半固體培養(yǎng)：培養(yǎng)基為試管高度的1/3,滅菌后垂直

待凝。10、平板：100ml5~6個平板

一個平板大約15~20ml培養(yǎng)基，鋪滿皿底高

1.5~2mm第26頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四滅菌與消毒滅菌

采用強烈的理化因素，使微生物永遠失去其生長繁殖的能力，如121℃高壓滅菌20min。消毒

采用一種較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的病原菌。如用70%酒精進行皮膚表面的消毒。防腐

利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，防止食品發(fā)生霉腐。第27頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四物理消毒滅菌1、干熱滅菌法

原理：細胞內蛋白質凝固變性

方法：火焰灼燒滅菌&熱空氣滅菌

特點：溫度高160℃~180℃，2h2、濕熱滅菌法

原理:高溫使原生質中的蛋白質凝固變性，破壞酶

的活性。

方法：高壓蒸汽滅菌法第28頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四3、紫外線滅菌法

原理：（1）誘導胸腺嘧啶二聚體形成，抑制DNA

復制；

（2）輻射使O2電離為[O]，然后形成O3，

或是水形成H2O2；

缺點：殺菌能力較強，但穿透力弱，一張薄紙，

玻璃或水層就可濾過大部分的紫外線。對象：空氣和表面殺菌第29頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四4、過濾除菌

原理：通過機械作用濾去液體或其氣體中的細菌。

對象：不能采用加熱滅菌的物質，如維生素、血

清、抗生素、酶液等

缺點：濾量有限，只適用于實驗室小量溶液

（20ml以下）的過濾除菌。5、化學藥劑消毒滅菌第30頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四高壓蒸汽滅菌法1、在高壓鍋內加入一定量的水，將包扎好的物品放入物品框中。2、接通電源，進行加熱。3、將排氣閥打開，待排出大氣后關閉排氣閥；或關閉排氣閥，待壓強升到0.5kg/cm2時，再打開排氣閥，待壓強回到0時關閉排氣閥。4、壓強達到1kg/cm2時，滅菌鍋內的溫度為121℃，維持20~30min。5、滅菌時間一到，切斷電源，待壓強降至0打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。第31頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四注意事項1、加上鍋底水，防止干燒；2、鍋內物品之間留有縫隙，利于蒸汽穿透；3、物品放置不宜過多，過擠，鍋內應留出三分之一空間。以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。4、三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。5、盡可能排出鍋內冷空氣；6、滅菌結束后，要緩慢放氣降壓（尤其是液體培養(yǎng)基滅菌），切勿突然打開排氣閥降壓，會引起瓶子爆破或培養(yǎng)基沸騰沖出容器，污染試管塞，瓶口布。第32頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四微生物的無菌操作實驗前無菌室的紫外線殺菌

第33頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四注意事項1、操作區(qū)消毒：無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用70酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。2、消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。3、實驗用品，如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用要用70%酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺，同時紫外線消毒。第34頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四4、操作：開啟無菌操作臺風機運轉10分鐘后，才可開始實驗操作，動作要準確敏捷，但又不能太快，幅度不能太大，以防空氣流動，增加污染機會。5、必要物品，如試管架，移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完后應及時移出,以利氣體流通。6、實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。第35頁，共40頁，2023年，2月20日，星期四7、為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放在右側，左手用品在左側，酒精燈置于中央。8、工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。9、實驗結束后，將實驗物品帶出工作臺，如需要繼續(xù)進