轉錄優(yōu)秀課件

第三章生物信息的傳遞(上)-----從DNA到RNA目錄第一節(jié)RNA的轉錄第二節(jié)啟動子與轉錄起始第三節(jié)原核生物與真核生物mRNA的特征比較第四節(jié)終止和抗終止第五節(jié)內含子的剪接、編輯及化學修飾

前言1957年Crick提出了中心法測(centraldogma)

DNA→RNA→蛋白質

1970Crick又作了部分修改：

DNARNA蛋白質基因表達包括轉錄和翻譯兩個階段。轉錄：指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了T→U之外）的RNA單鏈的過程。1963J.Marmur和DotySpiegelnan區(qū)分有義鏈。采用枯草桿菌的SP8噬菌體為材料。編碼鏈（有意義鏈）：與mRNA序列相同的那條DNA鏈模板鏈（反義鏈）：根據堿基互補原則指導mRNA合成的DNA鏈模板鏈與非模板鏈第一節(jié)RNA的轉錄一、轉錄的基本過程二、轉錄機器的主要成分一、轉錄的基本過程無論真核還是原核，其轉錄的基本過程都包括：模板識別轉錄起始通過啟動子轉錄的延伸和終止轉錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈是通過啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導致轉錄重新開始。一旦RNA聚合酶成功的合成9個以上的核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉錄就進入正常的延伸階段RNA聚合酶離開啟動子，沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷深長的過程就是轉錄的延伸。當RNA鏈延伸到轉錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉錄泡瓦解，DNA恢復成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來，這就是轉錄的終止。

真核生物轉錄的基本模式是輔助因子與酶結合，識別啟動子，酶進行轉錄。細菌中是RNA聚合酶識別啟動子。怎樣用實驗證實mRNA的合成總是延著5-3′方向進行的？E.coli在0C時需13秒鐘才能加上一個核苷酸，但在37C每秒就可加上40個核苷酸;利用這個差別以14C來標記U,在0C培養(yǎng)E.coli，。提取這種正在伸長的mRNA分子發(fā)現14C標記首先出現在伸長的3′端，因此可以證明合成是延著5′-3′方向進行的。RNApol執(zhí)行多功能(1)識別DNA雙鏈上的啟動子；(2)使DNA變性在啟動子處解旋成單鏈；(3)通過閱讀啟動子序列，RNApol確定它自己的轉錄方向和模板鏈。(4)最后當它達到終止子時，通過識別停止轉錄。原核生物的RNA聚合酶大腸桿菌RNA聚合酶由2個α亞基、一個β亞基、一個β′亞基和一個ω亞基組成，稱為核心酶。加上一個σ亞基后則成為聚合酶全酶研究發(fā)現，由β和β′亞基組成了聚合酶的催化中心，它們在序列上與真核生物RNA聚合酶的兩個大亞基有同源性。Β亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結合。核心酶具有的四個功能位點

ααβ’β★DNA/RNA雜交位點(β)

★D.S.DNA解鏈位點(α)

★D.S.DNA重旋(α)

★啟動子識別位點

σ★DNA無義鏈結合位點(β’)

大腸桿菌中的σ因子能識別并與啟動子區(qū)的特異性序列相結合因子基因功能-35區(qū)間隔（bp）-10區(qū)σ70rpoD廣泛TTGACA16-18TATAATσ32rpoH熱休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTAσ54rpoN氮代謝CTGGNA6TTGCA轉錄的起始從化學過程來看是單個核苷酸與開鏈啟動子-酶復合物相結合構成新生RNA的5‘端，再以磷酸二酯鍵的形式與第二個核苷酸相結合，起始的終止反映在σ因子的釋放α-鵝膏蕈堿的抑制作用RNA聚合酶I：不抑制RNA聚合酶II：抑制RNA聚合酶III：反應不一（二）轉錄復合物轉錄可被分為4個階段，即啟動子的選擇、轉錄起始、RNA鏈的延伸和終止。除了RNA聚合酶之外，真核生物轉錄起始過程中至少還需要7種輔助因子參與。蛋白質亞基數亞基的相對分子質量/103功能RNA聚合酶Ⅱ1210~220催化RNA的生物合成TBP138與啟動子上的TATA區(qū)相結合TFⅡA312，19，35使TBP及TFⅡB與啟動子的結合比較穩(wěn)定TFⅡB135與TBP相結合，吸引RNA聚合酶和TFⅡF到啟動區(qū)上TFⅡD1215~250與各種調控因子相互作用TFⅡE234，57吸引TFⅡH，有ATP酶及解鏈酶活性TFⅡF230，74結合RNA聚合酶Ⅱ并在TFⅡB幫助下組織聚合酶與非特異性DNA序列相結合TFⅡH1235~89在啟動子區(qū)解開DNA雙鏈，使RNA聚合酶Ⅱ磷酸化，接納核苷酸切除修復體系

轉錄因子轉錄復合體TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的轉錄起始第二節(jié)啟動子與轉錄起始大腸桿菌RNA聚合酶與啟動子的相互作用主要包括：啟動子區(qū)的識別酶與啟動子的結合σ因子的結合與解離。轉錄單元（transcriptionunit）：一段從啟動子開始至終止子結束的DNA序列。RNA聚合酶從轉錄起點開始沿著模板前進，直到終止子為止，轉錄出一條RNA鏈。轉錄起點是指與新生RNA鏈第一個核苷酸相對應DNA鏈上的堿基，研究證明通常為一個嘌呤。上游：把起點前面，即5‘末端的序列下游：其后面即3‘末端的序列一.啟動子區(qū)的基本結構啟動子是一段位于結構基因5‘端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確的相結合并具有轉錄起始的特異性。原核啟動子RNA聚合酶結合區(qū)，此區(qū)域在轉錄起始位點附近。RNA聚合酶結合到起始點緊鄰的上游，然后滑動到起始點。

真核啟動子DNA上的一個區(qū)域，其中含有可用通常效率和適當調控下支持轉錄的結合位點。RNA聚合酶通過轉錄因子結合于起始點附近。原核生物一個經典的原核生物啟動子主要由4個區(qū)域組成：-35序列、-10序列、轉錄起點、-10序列和-35序列間的距離。-35序列為RNA聚合酶σ因子的識別位點。RNA聚合酶與該位置接觸在啟動子區(qū)域形成封閉復合物。-10序列為RNA聚合酶牢固結合位置并在此解鏈，形成開放起始復合物。典型啟動子的結構

-35

-10

轉錄起點TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp1.-10序列：-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）發(fā)現，故也稱為Pribnow框盒（Pribnowbox）。保守序列為T80A95T45A60A50T9位于-10bp左右，A.T較豐富，易于解鏈。其功能是:(1)RNApol緊密結合;(2)形成開放啟動復合體；

(3)使RNApol定向轉錄。-10序列對轉錄的效率影響TATAAT→AATAAT，轉錄效率下降,稱為下降突變（downmutation）。TATGTT→TATATT，轉錄效率上升，為上升突變（upmutation）。以上突變?yōu)楹螘绊戅D錄效率？前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆積能，后者可能是由于堆集能降低和氫鍵的減少，2.-35序列-35序列又稱為Sextama盒（Sextamabox），其保守序列為（T82T84G78A65C54A45）其功能是:(1)為RNApol的識別位點。

σ亞基識別-35序列，為轉錄選擇模板(2)-35和-10序列的距離是穩(wěn)定的，此與RNApol的結構有關。真核生物真核生物細胞中有三種轉錄方式，分別由三種RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ催化，因此由三種啟動子。根據啟動子的不同，將真核生物的基因分為三類，即Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因。這三種基因分別由三種啟動子控制，它們在結構上各有特點。RNA聚合酶Ⅰ其啟動子間的差異最小，因為其只轉錄rRNA基因。人的RNA聚合酶Ⅰ的啟動子主要由兩部分組成：核心啟動子足以使轉錄起始，上游調控元件（upstreamcontrolelement,UCE）,可以大大地提高核心啟動子的轉錄起始效率。RNA聚合酶Ⅱ其主要負責蛋白質基因和部分核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)的轉錄，其啟動子結構最為復雜。RNA聚合酶Ⅱ識別的啟動子由轉錄起點、TATAbox和CAATbox以及上游啟動子成分，如增強子等組成。有些只含有核心啟動子中兩個成分之一，有些則無核心啟動子。這些缺失核心啟動子的基因仍可轉錄。RNA聚合酶II啟動子上游元件upstreamelementTATAbox(TATAAAA)位于-25~-35bpCAATbox(GGCCAATCT)，位于-75bpGCbox(GGGCGG)，位于-90bpoctamer(an8bpelement).上游啟動子元件（UPE）表12-4哺乳動物RNAPolⅡ上游轉錄因子結合的元

元件 保守序列 結合DNA的長度蛋白質因子TATAbox TATAAAA ～10bp TBP CAATbox GGCCAATCT ～22bp CTF/NF1GCbox GGGCGG ～20bp SP1 Octamer ATTTGCAT ～20bp Oct-1Octamer ATTTGCAT 23bp Oct-2KB GGGACTTTCC ～10bp NFKB ATF GTGACGT ～20bp ATF B.Lewin:《GENES》Ⅵ.1997,Table28.2RNA聚合酶Ⅲ其產物為一些分子量較小的細胞質RNA，包括tRNA,5srRNA,U6RNA等。包括三種類型：位于基因內部，沒有TATA盒框，有內部轉錄控制區(qū)(internalcontrolregion,ICR)組成，如5sRNA基因；位于基因上游，有兩個基本成分PSE(proximalsequenceelement,近端順序元件)和TATA盒框，如U6RNA基因；混合啟動子，即含有如5srRNA基因的內控區(qū)，又有如U6RNA基因的上游啟動子。二.啟動子區(qū)的識別RNA聚合酶并不直接識別堿基對本身，而是通過氫鍵互補的方式加以識別。由含70RNA多聚酶全酶識別的典型大腸桿菌啟動子大腸桿菌中部分啟動子上的一致順序三.酶與啟動子區(qū)的結合1.全酶與模板的DNA接觸，生成非專一的,不穩(wěn)定的復合物在模板上移動；2.起始識別：全酶與－35序列結合，產生封閉的酶-啟動子二元復合物（closedbinarycomplex）；3.全酶緊密地結合在-10序列處，模板DNA局部變性，形成開放的啟動子二元復合體；4.酶移動到I，第一個rNTP轉錄開始,σ因子釋放,形成酶-啟動子-rNTP三元復合體（ternarycomplex）。延伸核心酶負責RNA的延伸RNA延伸方向5’→

3’RNA轉錄延伸期轉錄泡模型RNA鏈延伸的兩種可能模式RNA鏈的延伸RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:(1)σ和1/3的RNApol結合成全酶，或在非特異位點的松散復合體中，或在啟動子中的二元復合體中；(2)其中半數的核心酶從事轉錄；(3)余下的核心酶大量存在于閉合松散復合體中；(4)估計數量很少的全酶是游離的。四.-10區(qū)和-35區(qū)的最佳距離在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離大約是16~19bp，小于15bp或大于20bp都會降低啟動子的活性。五.增強子Enhancer及其功能增強子是與轉錄起始有關的位點，具有增強轉錄起始的作用相對于啟動子來說，增強子的位置不是固定的，變化很大增強子可在兩個方向上起作用其特點是：①具有遠距離效應。②無方向性。③順式調節(jié)。④無物種和基因的特異性。⑤具有組織的特異性。⑥有相位性。其作用和DNA的構象有關。⑦有的增強子可以對外部信號產生反應。六.真核生物啟動子對轉錄的影響TATA區(qū)主要作用是使轉錄精確的起始，如果除去或進行堿基突變，轉錄產物下降的相對值不如CAAT區(qū)或GC區(qū)突變后明顯，但發(fā)現所獲得的RNA產物起始點不固定。CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉錄起始頻率，基本不參與起始位點的確定。CAAT區(qū)對轉錄起始頻率的影響最大。真核細胞中存在著大量不同的轉錄調控因子?；蜣D錄實際上是RNA聚合酶、轉錄調控因子和啟動子各種調控元件相互作用的結果。第三節(jié)原核生物與真核生物mRNA的特征比較一、原核生物mRNA的特征原核生物mRNA的半衰期短許多原核生物mRNA以多順反子的形式存在原核生物mRNA的5‘端無帽子結構，3’端沒有或只有較短的poly(A)結構4.原核生物起始密碼子AUG上游7~12個核苷酸處有一被稱為SD序列的保守區(qū)，其與16SrRNA3‘端反向互補。幾乎所有mRNA都可以被分成3部分：編碼區(qū)、位于AUG之前的5‘端上游非編碼區(qū)以及位于終止密碼子之后不翻譯的3’端下游非編碼區(qū)。二.真核生物mRNA的特征1.真核生物mRNA的5‘端存在“帽子”結構帽子結構是GTP和原mRNA5‘三磷酸腺苷（或鳥苷）縮合反應的產物，新加上的G與mRNA鏈上所有其他核苷酸方向正好相反，像一頂帽子倒扣在mRNA鏈上，故而得名。三種帽結構mRNA5’端帽結構形成過程2、絕大多數真核生物mRNA具有poly(A)尾巴幾乎所有真核基因的3‘末端轉錄終止位點上游15~30bp處的保守序列AAUAAA對于初級轉錄產物的準確切割及加poly(A)是必需的。加poly（A）時需要由內切酶切開mRNA3‘端的特定部位，然后由poly(A)合成酶催化多聚腺苷酸的反應。加Poly(A)的反應第一步加一個短的寡聚A序列（10nt），此反應依賴于AAUAAA序列；反應由poly（A）聚合酶在特殊因子指導下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的長度。此反應并不需要AAUAAA序列，但需要一個識別寡聚A并指導poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。第四節(jié).終止和抗終止RNA聚合酶啟始基因轉錄后，它就會沿著模板5‘→3’方向不停的移動，合成RNA鏈，直到碰上終止信號時才與模板DNA相脫離并釋放新生RNA鏈。終止發(fā)生時，所有參與形成RNA-DNA雜合體的氫鍵都必須被破壞，模板DNA鏈才能與有意義鏈重新組合成DNA雙鏈。研究RNA鏈終止時遇到最常見的問題是3‘端核苷酸的定位，因為活細胞內部根據終止信號正確終止的RNA與一個經過剪接的RNA在3’端沒有兩樣，都是-OH基團，而研究5‘時，只有初生RNA上才有一個三磷酸基團，任何經過剪接修飾的5’端不再帶有這個基團。一、不需ρ因子的終止終止子結構終止位點上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉錄產生的RNA容易形成發(fā)卡式結構。在終止位點前面有一段由4~8個A組成的序列，所以轉錄產物的3‘端為寡聚U，這種結構特征的存在決定了轉錄的終止。在新生RNA中出現發(fā)卡式結構會導致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5'端的正常結構。寡聚U的存在使雜合鏈的3'端部分出現不穩(wěn)定的rU·dA區(qū)域。終止子結構不依賴Rho因子的轉錄終止二、需ρ因子的終止ρ因子是一個相對分子質量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉錄復合物中解離出來，從而終止轉錄。有人認為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產生的能量，沿著5'→3'方向朝RNA聚合酶移動，到達RNA的3'-OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉錄和核苷三磷酸酶兩種功能。三、抗終止破壞終止位點RNA的莖-環(huán)結構依賴于蛋白質因子的轉錄抗終止第五節(jié)、內含子的剪接、編輯及化學修飾一、RNA中的內含子真核基因表達往往伴隨著RNA的剪接過程，從mRNA前體分子中切除被稱為內含子的非編碼區(qū)，并使基因中被稱為外顯子的編碼區(qū)拼接形成成熟mRNA.RNA加工過程及其生理過程加工過程推測的生理功能加帽子反應mRNA從細胞核向細胞質運轉，翻譯起始加poly(A)反應轉錄終止，翻譯起始和mRNA降解RNA的剪接從mRNA，tRNA和rRNA分子中切除內含子RNA的切割從前體RNA中釋放成熟tRNA和rRNA分子內含子類型細胞內定位GU-AG細胞核，前mRNA（真核）AU-AC細胞核，前mRNA（真核）Ⅰ類內含子細胞核，前rRNA（真核），細胞器RNA，少數細菌RNAⅡ類內含子細胞器RNA，部分細菌RNAⅢ類內含子細胞器RNA雙內含子細胞器RNAtRNA前體中的內含子細胞核，tRNA前體（真核）生物體內的各種內含子核酶(Ribozyme)1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜蟲rRNA時發(fā)現的；T.Cech由核糖核酸（ribonucleicacid）和酶（enzyme）這兩個詞“重組”成一個新的詞：“Ribozyme”；是指本質為RNA或以RNA為主含有蛋白質輔基的一類具有催化功能的物質。和傳統(tǒng)酶的區(qū)別：(1)一般的酶是純的蛋白質，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA；(2)核酶既是催化劑又是底物。而酶僅催化反應。核酶發(fā)現的意義（1）突破了酶的概念.是一種自體催化；（2）揭示了內含子自我剪接的奧秘；促進了RNA的研究。（3）為生命的起源和分子進化提供了新的依據。二、RNA的剪接剪接位點是通用的，對任一單一的RNA來說無特異性，任一前體對剪接也不提供特異的信息。剪接裝置也是通用的，無組織特異性，一個RNA可在任何細胞中剪接，不管這個RNA是否是在這個細胞中合成的。GT-AG規(guī)則剪接位點序列高度保守，只存在于內