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文檔簡介

第二章

基因工程參考書:1.《基因工程》孫明高等教育出版社2.《基因工程原理》吳乃虎科學(xué)出版社3.《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.Sambtook,EFFrish,TManiatis.金冬雁等譯,科學(xué)出版社4.英國PrinciplesofGeneManipulation5.《基因操作原理》中文版瞿禮嘉、顧紅雅譯高等教育出版社原理:通過基因重組,讓目的基因在受體細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)。操作水平:DNA分子水平結(jié)果:定向地改造生物的遺傳性狀,獲得所需要的品種。利用DNA體外重組或PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因,或是用人工合成的方法獲取基因,然后經(jīng)過一系列切割,加工修飾,經(jīng)連接反應(yīng)形成重組DNA分子,再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞(轉(zhuǎn)化),以期獲得基因表達(dá)的過程。什么是基因工程?

血液供血者受血者注射器

目的基因供體受體載體

基因工程(打比方)將供體或在細(xì)胞外產(chǎn)生的核酸(物質(zhì))分子插入到病毒(virus)、質(zhì)粒(plasmid)或其它載體系統(tǒng)(vectersystem)中從而形成一種新的可連續(xù)繁殖的有機(jī)體再整合到那些本來不含該類物質(zhì)的宿主(host)—受體中基因工程的誕生與發(fā)展20世紀(jì)70年代,PaulBerg及其同事第一個創(chuàng)造重組DNA分子PaulBerg基因工程的誕生與發(fā)展1975,發(fā)現(xiàn)分子克隆工具酶利用限制性內(nèi)切酶(Restriction

endonuclease)切割產(chǎn)生特殊DNA片段的能力使得純化那些DNA片段成為可能基因工程的誕生與發(fā)展1978年,重組胰島素1979年,人類生長激素基因工程的誕生與發(fā)展什么是基因?編碼蛋白質(zhì)或RNA等具有特定功能產(chǎn)物的遺傳信息的基本單位,是染色體或基因組的一段DNA序列。包括編碼序列(外顯子)、編碼區(qū)前后對于基因表達(dá)具有調(diào)控功能的序列和單個編碼序列間的間隔序列(內(nèi)含子)。DNA

exon1intron1exon2intron2exon3intron3exon4

轉(zhuǎn)錄

Pro-mRNAexon1intron1exon2intron2exon3intron3exon4mRNA剪接翻譯蛋白質(zhì)

真核生物中蛋白質(zhì)合成過程中外顯子和內(nèi)含子的關(guān)系

生物進(jìn)化的分子基礎(chǔ)—基因用進(jìn)廢退,獲得性遺傳達(dá)爾文進(jìn)化論拉馬克進(jìn)化論過度繁殖,生存斗爭遺傳和變異,適者生存

基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是可切割的基因是可轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間有對應(yīng)關(guān)系遺傳密碼通用基因可以復(fù)制遺傳基因工程研究的理論依據(jù)3‘起始密碼子5‘腺嘌呤(A)胸腺嘧啶(T)胞嘧啶(C)鳥嘌呤(G)(1)獲得目的基因;

(2)與克隆載體連接,形成新的重組DNA分子;

(3)用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞,并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳;

(4)對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定;

(5)對獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng),獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。重組DNA操作一般步驟生物材料mRNADNARNAcDNA文庫基因組文庫人工合成目的基因克隆載體受體細(xì)胞重組DNA克隆子轉(zhuǎn)基因生物基因工程操作的工具限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因片斷從受體細(xì)胞內(nèi)提取,需要基因的剪刀—限制性核酸內(nèi)切酶。將目的基因與質(zhì)粒DNA連接,需要基因的針線—DNA連接酶。將目的基因運(yùn)入大腸桿菌,需要基因的運(yùn)輸工具—運(yùn)載體。

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)定義是一類能識別雙鏈DNA中特殊的核苷酸序列,并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。類型Ⅰ型限制酶Ⅱ型限制酶III型限制酶不同限制酶能專一地識別不同的特異核苷酸序列限制性內(nèi)切酶的命名Ⅱ型限制酶的特性

識別序列<6個:如:AsuⅠ5’-GGNCC-3’(5個)

MboⅠ5’-GATC-3’(4個)>6個:如:NotⅠ5’-GCGGCCGC-3’(8個)=6個(大多數(shù)):如:EcoRⅠ5’-GAATTC-3’有的限制酶識別序列包含在另一種限制酶內(nèi)。

如:Sau3A識別:GATC

BamHⅠ識別:GGATCC有的限制酶識別多種核苷酸序列。

如:HindⅡ識別4種核苷酸序列:5’-CTPyPuAC-3’

(Py→嘧啶堿基C或T;Pu→嘌呤堿基A或G)(a)5’-P單鏈延伸的粘性末端(b)3’-OH單鏈延伸的粘性末端①粘性末端(粘端)-GAATTC--CTTAAG-GAATTCCTTAAG如:EcoRⅠ5’3’5’3’5’3’5’3’-CTGCAG--GACGTC-CTGCAGGACGTC如:PstⅠ5’3’5’3’5’3’5’3’各種限制酶的切割類型是各式各樣的,切割后形成各種粘性末端或平整末端;Ⅱ型限制酶的切割類型

②平頭末端(平端)-CCCGGG--GGGCCC-CCCGGGGGGCCC如:SmalⅠ5’3’5’3’5’3’5’3’各種限制酶的切割類型是各式各樣的,切割后形成各種粘性末端或平整末端;Ⅱ型限制酶的切割類型

同裂酶(isoschizomer)

有一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶序列,這類酶特稱為同裂酶。同裂酶的切點(diǎn)位置可相同或不同。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ(a)切點(diǎn)位置相同CCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGGC+XmaⅠCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+SmaⅠ(b)切點(diǎn)位置不相同同裂酶(isoschizomer)

有一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶序列,這類酶特稱為同裂酶。同裂酶的切點(diǎn)位置可相同或不同。單酶切法雙酶切法部分酶切DNA分子片段化天然DNA或化學(xué)合成的DNA常需酶切成可連接重組的DNA片段,即DNA分子的片段化。Hind

IIISalI1、具有互補(bǔ)粘性末端片段的連接2、具平末端DNA片段之間的連接3、DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接4、DNA片段加桿后連接

DNA片段連接DNA連接酶

E.coliDNA連接酶只能催化互補(bǔ)粘性末端之間的連接DNA連接酶(DNAligase)能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3‘-OH末端與5’-P末端之間形成磷酸二酯鍵,使末端連接。

T4DNA連接酶催化互補(bǔ)粘性末端和平末端之間的連接,但平末端之間連接的效率比較低。具有互補(bǔ)粘性末端片段的連接

E.coliDNA連接酶具有互補(bǔ)粘性末端和平末端片段的連接EcoRIEcoRI

T4DNA連接酶末端轉(zhuǎn)移酶+核酸外切酶+DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接核酸外切酶(exonuclease):在核酸水解酶中,是具有從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸作用的酶的修飾作用CTAGAAGC共同的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)DNA連接酶DNA片段末端加桿后連接外切酶修飾酶切要讓一個從甲生物細(xì)胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá),首先得將這個基因送到乙生物的細(xì)胞內(nèi)去。能將外源基因送入細(xì)胞的工具就是運(yùn)載體1、條件:②含有限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)①能自我復(fù)制③含有篩選標(biāo)記,一般為抗性基因或報告基因④能啟動外源目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯⑤能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存2、種類質(zhì)粒、噬菌體、病毒、不同DNA片段組合載體

運(yùn)載體-基因克隆載體質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子質(zhì)??寺≥d體大腸桿菌質(zhì)粒載體可以克隆10kb以下的片段細(xì)菌人工染色體克隆載體一般在10kb以下,能承載40kb左右的外源片段。其他種類的載體包括:PCR克隆載體、噬菌體克隆載體、細(xì)菌克隆載體、病毒克隆載體、穿梭克隆載體、細(xì)菌人工染色體、細(xì)菌表達(dá)載體、真核表達(dá)載體、昆蟲細(xì)胞載體、酵母表達(dá)載體、體外表達(dá)載體、熒光蛋白載體、雙雜交載體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)載體、siRNA表達(dá)載體、熱休克載體、報告基因載體、亞細(xì)胞定位載體、轉(zhuǎn)座子構(gòu)建載體、噬菌體展示載體載體種類基因操作的基本步驟獲取目的基因形成重組DNA分子將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞4.篩選含有目的基因的受體細(xì)胞5.目的基因的表達(dá)將需要的基因從供體生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來取出DNA用限制酶切斷DNA

目前被較廣泛提取使用的目的基因有:蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。提取目的基因的方法1、直接分離基因細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序雙鏈DNA加熱至90-95℃變性解旋成為單鏈DNA,成為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模版降溫至37-60℃與模版復(fù)性結(jié)合升溫至70-75℃,DNA聚合酶催化引物按5‘-3’延伸,合成模版DNA鏈的互補(bǔ)鏈N個循環(huán),達(dá)到2n的拷貝數(shù)

2、利用PCR擴(kuò)增目的基因PCR原理

2、利用PCR擴(kuò)增目的基因引物1目的基因已知序列已知序列引物2PCR擴(kuò)增含有目的基因的DNA片段1、必須知道待擴(kuò)增目的基因DNA片段的核苷酸序列2、待擴(kuò)增片段兩端長約20bp的序列已知,3、允許擴(kuò)增的DNA片段長度一般在1kb以內(nèi)4、擴(kuò)增未知序列或長達(dá)幾千bp的大基因,需要特殊類型的PCR策略5、RT-PCR、免疫PCR、巢式PCR、實(shí)時熒光PCR、原位PCR技術(shù)等30幾種PCR之歌

從前你要擴(kuò)增DNA,

總有培養(yǎng)大批細(xì)胞的重任要你背。

這時有個家伙叫KaryMullis博士的,

他鉆出來說體外合成也OK!只消把你的模板混上緩沖液,

再加些引物——

核苷和聚合酶。變性,退火,和延伸。

加熱~涼涼~加熱~好神奇?。‘?dāng)你想要檢測突變,來啊,做PCR吧!

當(dāng)你想要基因重組,來啊,做PCR吧!

當(dāng)你想要偵破大案,來啊,做PCR吧!

當(dāng)你想知道孩子他爹到底是哪個混蛋,來啊,做PCR吧!!!Bio-rad

推出的

ScientistsforbetterPCR

3、人工基因合成法直接合成法:已知某基因的序列的前提下,可以用化學(xué)方法合成或用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲取目的因.(如胰島素基因)逆轉(zhuǎn)錄法:以信使RNA為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成合成DNA(基因)。根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序,再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。DNA合成儀PCR擴(kuò)增儀5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’******************磷酸化磷酸化磷酸化退火連接退火連接退火連接粘性末端粘性末端合成的全基因DNA目的基因化學(xué)合成全片段酶促法連接示意圖目的基因與運(yùn)載體結(jié)合--形成重組DNA提取質(zhì)粒并用限制酶切割用連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接用限制酶切割目的基因和用相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個切口,將目的基因插入切口處,讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對后,在DNA連接酶的作用下連接形成重組DNA分子基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。如用質(zhì)粒作運(yùn)載體,則選大腸桿菌為受體細(xì)胞目的基因可以隨著受體細(xì)胞進(jìn)行快速的繁殖,在很短的時間內(nèi)獲得大量的基因。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞并擴(kuò)增將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞并擴(kuò)增將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增轉(zhuǎn)化:外源裸露DNA進(jìn)入受體細(xì)胞,并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)染:如果外源DNA分子是病毒或者噬菌體DNA或RT-DNA,那么把此過程也稱為轉(zhuǎn)染?;衔镎T導(dǎo)轉(zhuǎn)化:感受態(tài)細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)化:高電壓脈沖產(chǎn)生瞬間通道超聲波處理轉(zhuǎn)化:擊穿細(xì)胞膜形成膜通道脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化:磷質(zhì)雙層包裹DNA磷酸鈣轉(zhuǎn)染法:動物細(xì)胞捕獲DNA-磷酸鈣沉淀物常用轉(zhuǎn)化法篩選含有目的基因的受體細(xì)胞

前三步的處理十分繁鎖,為保證目的基因得到有效利用,通常用大量的受

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