細(xì)工第公開課課件

第九章

植物體細(xì)胞無性系變異

與突變體的篩選本章學(xué)習(xí)重點(diǎn)影響體細(xì)胞無性系變異的因素；體細(xì)胞無性系突變體的篩選程序。第一節(jié)

植物體細(xì)胞無性系變異一、體細(xì)胞無性系變異的普遍性二、體細(xì)胞無性系變異的類型三、體細(xì)胞無性系變異的遺傳基礎(chǔ)四、體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)可以通過有性世代和無性繁殖世代穩(wěn)定保持的變異。二、體細(xì)胞無性系變異的類型遺傳變異非遺傳變異生理適應(yīng)后生遺傳變異

是指由于某種外界條件存在而引起的性狀變異，這種變異會(huì)隨著特定外界因素的消失而消失。

又稱為表觀遺傳變異，是指由于外部影響導(dǎo)致基因表達(dá)的改變，從而引起表型上的變異，在有性世代和無性世代都不能穩(wěn)定保持。三、體細(xì)胞無性系變異的遺傳基礎(chǔ)1.染色體數(shù)目變異2.染色體結(jié)構(gòu)變異3.基因突變4.基因擴(kuò)增5.基因丟失7.DNA堿基修飾8.轉(zhuǎn)座子的激活9.基因重排整倍性變異非整倍性變異

在離體培養(yǎng)條件下，植物細(xì)胞基因中的某些堿基序列丟失而導(dǎo)致基因失活。一些基因中的某些位置甲基化后，其基因就會(huì)表現(xiàn)為不活躍的非表達(dá)基因，而當(dāng)這些位置去甲基化后，則活躍表達(dá)。是指DNA分子內(nèi)部核苷酸序列的重新排列，起源于DNA復(fù)制過程中的同源染色體重組和缺失、倒位及插入。四、體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)自發(fā)變異人工誘發(fā)變異物理誘變化學(xué)誘變影響體細(xì)胞無性系變異的因素植物激素物理狀態(tài)供體植物的遺傳背景外植體的類型及生理狀態(tài)培養(yǎng)基繼代次數(shù)植株的再生方式外植體細(xì)胞中預(yù)先存在的變異

以分化程度較高的組織或細(xì)胞為外植體，在較高的激素濃度條件下誘導(dǎo)愈傷組織，并經(jīng)過較長時(shí)間的繼代培養(yǎng)，然后再分化形成再生植株，有可能得到較高頻率的體細(xì)胞無性系變異。

（二）人工誘發(fā)變異1.物理誘變以組織器官為誘導(dǎo)材料，可以選擇輻射強(qiáng)度較大的γ射線、中子等進(jìn)行輻射。以細(xì)胞或原生質(zhì)體，則可選擇X射線、紫外線等。特別是以原生質(zhì)體為誘導(dǎo)材料時(shí)，可以使用紫外線照射。第二節(jié)植物體細(xì)胞無性系

突變體的篩選一、突變體的篩選方法二、突變體篩選的一般程序三、植物體細(xì)胞無性系變異的應(yīng)用一、突變體的篩選方法田間表型選擇法離體篩選綠島法直接篩選法間接篩選法（一）田間表型選擇法

即從田間栽培的大量再生植株中篩選出優(yōu)良變異單株。工作量雖然大，但較為簡(jiǎn)單，能直觀表現(xiàn)性狀變化，利于直接判斷改良性狀。目前育成的有關(guān)品種多是采用這一方法獲得的。2.間接選擇法是一種借助于與突變表現(xiàn)有關(guān)的性狀作為選擇指標(biāo)或篩選壓的篩選方法。林定波等將錦橙株心細(xì)胞愈傷組織的懸浮細(xì)胞經(jīng)γ射線照射，然后在高濃度脯氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選，獲得了抗寒體細(xì)胞變異愈傷組織，其再生植株抗寒性比供體植株提高2.4℃。（三）綠島法γ射線使用除草劑后葉片上出現(xiàn)綠島切下綠色部位經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生抗性植株二、突變體篩選的一般程序34215誘變材料的選擇誘發(fā)突變突變細(xì)胞的篩選細(xì)胞增殖與植株再生突變體穩(wěn)定性鑒定ThankYou!基因擴(kuò)增

細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性地大量增加的現(xiàn)象，是細(xì)胞在短期內(nèi)為滿足某種需要而產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物的一種調(diào)控手段。轉(zhuǎn)座子

轉(zhuǎn)座子是基因組中一段可移動(dòng)的DNA序列，可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置。外植體的類型

再生植株的變異頻率：原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株＞細(xì)胞培養(yǎng)＞組織、器官培養(yǎng)性細(xì)胞培養(yǎng)的再生植株＞體細(xì)胞培養(yǎng)外植體的生理狀態(tài)◆同一種植物不同部位的外植體，變異頻率不同；◆分化程度較高的組織產(chǎn)生的再生植株更容易發(fā)生變異：

※以分生組織為外植體的再生植株變異頻率很低；

※以分化組織為外植體的再生植株容易發(fā)生變異。供體植物培養(yǎng)材料植株變異率（%）菠蘿幼果愈傷組織100腋芽愈傷組織34冠芽愈傷組織7香蕉莖尖離體繁殖材料9-25番茄幼葉愈傷組織75.8植物激素高濃度的細(xì)胞分裂素（6-BA）往往會(huì)引起體細(xì)胞基因突變、染色體的丟失等現(xiàn)象；高濃度的GA和IAA往往會(huì)造成畸形胚的高頻發(fā)生；TDZ使再生植株大多是白化苗或玻璃化苗。培養(yǎng)基物理狀態(tài)

一般來講，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞較固體培養(yǎng)的細(xì)胞易產(chǎn)生變異。繼代次數(shù)

由繼代次數(shù)引起的體細(xì)胞變異普遍存在。一般來說，培養(yǎng)時(shí)間越長，繼代次數(shù)越多，細(xì)胞變異的幾率就越高。植株的再生方式（1）由體細(xì)胞胚形成的再生植株變異性遠(yuǎn)小于由器官發(fā)生途徑形成的植株；（2）直接再生植株遺傳穩(wěn)定性較好；經(jīng)過愈傷組織階段形成的再生植株則容易發(fā)生變異。一般需考慮以下幾方面的問題：避免采用不能再生或難以再生的材料；要選用染色體穩(wěn)定的細(xì)胞系進(jìn)行起始誘導(dǎo)；要選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過誘變改變個(gè)別不良性狀。1.誘變材料的選擇培養(yǎng)細(xì)胞的來源愈傷組織懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體優(yōu)點(diǎn)：取材方便缺點(diǎn)：生長較懸浮細(xì)胞慢；接觸選擇劑不均勻；聚集體較大，抗性細(xì)胞不易正常生長；物理或化學(xué)誘變作用不均一。廣泛采用的材料；缺點(diǎn)：存在細(xì)胞聚集現(xiàn)象，影響誘變效果。優(yōu)點(diǎn)：是單細(xì)胞，容易被選擇劑選擇，可避免產(chǎn)生嵌合體；缺點(diǎn)是植株再生困難。2.誘發(fā)突變當(dāng)誘變處理時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入誘變劑，誘變處理后用大量稀釋法或用解毒劑終止誘變劑的作用。誘變處理的另一種方法是先在植株水平上進(jìn)行誘變處理，再在組織培養(yǎng)中篩選。5.突變體穩(wěn)定性鑒定（1）選擇出來的細(xì)胞或組織放在正常培養(yǎng)基中繼代幾次，仍表現(xiàn)變異性狀者為突變體；（2）再生植株水平鑒定：形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定，染色體觀察和核型分析，同工酶譜分析，分子標(biāo)記等（3）再生植株后代鑒定第十章植物種質(zhì)資源本章學(xué)習(xí)重點(diǎn)超低溫保存的基本程序超低溫保存的冷凍處理方法第十章超低溫保存4常溫限制生長保存2低溫保存法31概述一、概述種質(zhì)：是指親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞直接傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)資源：攜帶各種不同遺傳物質(zhì)的植物的總稱，包括栽培，野生及人工創(chuàng)造的各種植物的品種或品系。種質(zhì)（資源）保存利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，借以保存種質(zhì)資源，使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性，并能通過繁殖將其遺傳特性傳遞下去。種質(zhì)資源保存的方式原生境保存：建立保護(hù)區(qū)和保護(hù)地非原生境保存：異地保存（種質(zhì)圃和植物園保存）、種質(zhì)庫保存、離體保存種質(zhì)資源離體保存

指對(duì)離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理使之保存，在需要時(shí)可重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。種質(zhì)資源離體保存的優(yōu)點(diǎn)占用空間少，節(jié)省人力、物力和土地；便于種質(zhì)資源的交流利用及瀕危物種挽救和快繁；需要時(shí)，可以利用離體培養(yǎng)方法很快大量繁殖；避免自然災(zāi)害引起的種質(zhì)丟失。二、常溫限制生長保存（一）高滲保存法（二）生長抑制劑保存法（三）降低氧分壓保存法（四）饑餓法（五）干燥保存法鏈接三、低溫保存法

一種緩慢生長保存方法，是通過控制培養(yǎng)溫度來限制培養(yǎng)物各種生長因子的作用，使培養(yǎng)物生長減少到最低限度，延長繼代的時(shí)間間隔。一般在1-9℃（一些熱帶、亞熱帶植物在10-20℃）下培養(yǎng)，一般一年繼代一次。三、超低溫保存

是指將植物的離體材料經(jīng)過一定的方法處理后在超低溫（-196℃液氮）條件下進(jìn)行保存的方法。（一）基本原理離體材料在液氮中幾乎所有的細(xì)胞代謝活動(dòng)、生長基本處于停止的狀態(tài)，當(dāng)解凍后，又能恢復(fù)再生能力。

超低溫保存時(shí)，降溫冷凍和解凍過程中容易引起植物材料的傷害：細(xì)胞脫水過度，引起“溶液效應(yīng)”；細(xì)胞液態(tài)水減少，引起質(zhì)膜系統(tǒng)受損；細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，形成冰晶，直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。（二）冷凍防護(hù)劑

植物細(xì)胞含水量大，投放液氮中易引起組織和細(xì)胞死亡，故須借助于冷凍防護(hù)劑，防止細(xì)胞冰凍或解凍時(shí)引起過度脫水而遭到破壞?！籼岣呷芤赫硿裕柚贡纬?；◆增加細(xì)胞膜透性，加速胞內(nèi)水分向外滲出；◆防止“溶液效應(yīng)”的毒害；◆穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)大分子的正常結(jié)構(gòu)，阻止低溫對(duì)膜的傷害。冷凍防護(hù)劑的種類滲透型冷凍防護(hù)劑：DMSO、GA、EG、乙酰胺、PG等；非滲透型冷凍防護(hù)劑：PVP、蔗糖、葡聚糖、PEG等。（三）超低溫保存的基本程序1.保存材料的選取2.材料預(yù)處理3.冷凍處理和冷凍儲(chǔ)存4.解凍5.再培養(yǎng)6.超低溫保存后細(xì)胞或組織活力檢測(cè)1.保存材料的選取莖尖（芽）、腋芽原基、體細(xì)胞胚等是理想的離體保存材料。選取材料應(yīng)考慮：再生能力遺傳穩(wěn)定性抗凍性2.材料預(yù)處理（1）加速繼代：新分裂細(xì)胞含自由水少，不易形成大冰晶（2）提高培養(yǎng)基滲透壓：提高細(xì)胞的滲透壓（3）添加冷凍防護(hù)劑：5%-8%DMSO（4）低溫預(yù)處理：0-4℃低溫鍛煉3.冷凍處理和冷凍儲(chǔ)存（1）傳統(tǒng)的降溫冷凍方法（2）玻璃化保存法（3）包埋脫水法超低溫保存（4）包埋玻璃化法超低溫保存鏈接4.解凍快速解凍法慢速解凍法方法適用材料直接投入37-40℃水浴中解凍置于0℃或2-3℃的低溫下慢慢解凍原冷凍速度超過-15℃/min的材料；液泡小、含水量少的細(xì)胞液泡大、含水量高的細(xì)胞；木本植物的冬眠芽5.再培養(yǎng)

保存材料解凍后，需用液體培養(yǎng)基沖洗幾遍，除去冷凍防護(hù)劑的殘留毒害，然后在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使材料恢復(fù)生長，并再生植株。6.超低溫保存后細(xì)胞或組織活力檢測(cè)細(xì)胞活力檢測(cè)再培養(yǎng)的存活率遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)ThankYou!影響培養(yǎng)基凝固的因素：①瓊脂的量及質(zhì)量②培養(yǎng)基的pH值③高壓滅菌的溫度④高壓滅菌的時(shí)間總結(jié)：培養(yǎng)基表面1）超凈工作臺(tái)不正常2）接種器具滅菌不徹底3）操作不規(guī)范4）封口不嚴(yán)5）有內(nèi)生菌外植體周圍1）外植體滅菌不徹底2）接種工具滅菌不徹底3）操作不規(guī)范4）繼代培養(yǎng)時(shí)交叉感染培養(yǎng)基表面培養(yǎng)基內(nèi)部接種前接種后污染1）培養(yǎng)瓶封口不嚴(yán)2）培養(yǎng)基存放的環(huán)境中真菌孢子濃度過大1）培養(yǎng)基滅菌不徹底2）培養(yǎng)瓶不干凈而帶有耐高壓、高溫的雜菌以下現(xiàn)象或動(dòng)作容易引起污染：1.在接種室內(nèi)大聲說話2.用手撓頭3.頭部伸進(jìn)超凈工作臺(tái)內(nèi)4.雙手交叉取物5.手或手臂從培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、滅菌材料、接種工具等上方經(jīng)過6.金屬架、接種工具灼燒滅菌的時(shí)間不夠7.接種工具插入接種器具消毒器內(nèi)的深度不夠8.接種時(shí)試管或三角瓶不拿成斜角9.已滅菌的材料或物品拿到超凈工作臺(tái)外后又返回10.每次滅菌的材料過多11.植物材料接觸試管口或瓶口12.已滅菌的材料掉落臺(tái)面后又撿回接種13.接種工具接觸瓶口或其他帶菌物品后未重新滅菌就接種14.打開瓶口或封瓶口時(shí)瓶口未過火（一）高滲保存法通過提高培養(yǎng)基的滲透壓，達(dá)到抑制培養(yǎng)物生長的保存方法。

滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)：蔗糖、甘露醇、山梨醇、PEG等（二）生長抑制劑保存法

在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑以減緩培養(yǎng)材料的生長，達(dá)到長期保存種質(zhì)材料的保存方法。生長抑制劑：

ABA、青鮮素、CCC、B9、PP333等多效唑濃度依次為0、0.1、0.5、1.0mg/L矮壯素濃度依次為0、100、300、500mg/L（三）降低氧分壓保存法降低培養(yǎng)容器內(nèi)的氧分壓，改變培養(yǎng)環(huán)境的氣體狀況、抑制細(xì)胞的生理活性、延緩衰老。（四）饑餓法

減去培養(yǎng)基中的一種或幾種營養(yǎng)元素，或降低某些營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，使植株處于最小生長階段。（五）干燥保存法

對(duì)愈傷組織或體細(xì)胞胚進(jìn)行脫水處理，然后置于特定的培養(yǎng)基條件下保存。返回（1）傳統(tǒng)的降溫冷凍方法BCA慢速冷凍法快速冷凍法兩步冷凍法

逐級(jí)冷凍法DA.快速冷凍法從0℃或其他預(yù)培養(yǎng)溫度直接投入液氮中保存，降溫速度在1000℃/min以上。適于高度脫水的材料，如種子、花粉球莖或塊根等。B.慢速冷凍法在冷凍保護(hù)劑存在下，以0.1-10℃/min降溫速度從0℃降到-70℃，然后投入液氮中。此法適合于大多數(shù)植物材料。C.兩步冷凍法在冷凍保護(hù)劑存在下，先以0.5-4℃/min降溫速度從0℃降到-40℃，平衡0.5-2h，使細(xì)胞達(dá)到保護(hù)性脫水狀態(tài)，然后投入液氮中。D.逐級(jí)冷凍法材料經(jīng)保護(hù)劑在0℃預(yù)處理后，依次經(jīng)過-10℃、-15℃、-23℃、-40℃、-70℃冰浴處理（每級(jí)停留約5min），然后投入液氮中。（2）玻璃化保存法

將植物材料經(jīng)高濃度玻璃化保護(hù)劑處理使其快速脫水后直接投入液氮，使材料和玻璃化保護(hù)劑進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。玻璃化：是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形非晶體（玻璃態(tài)）的固化過程。此間水分子沒有發(fā)生重排，不形成冰晶，也不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和體積的變化，因而不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷和溶液效應(yīng)。但玻璃化保護(hù)劑對(duì)材料的毒害性較大。玻璃化保存的程序：

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脫水