分子生物學技術課件

分子生物學技術的原理及應用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication一、分子雜交與印跡技術

MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。

探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料標標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

（一）分子雜交斑點雜交：dotblottingDNAarrayDNAchips蛋白質芯片原位雜交：細胞原位雜交組織原位雜交

DNA點陣目錄是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。蛋白質芯片(proteinchip)（二）轉移印跡技術（一）DNA印跡技術

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質定性定量及相互作用研究。

③分子雜交實驗①②目錄放射自顯影照片目錄

二、聚合酶鏈反應

PolymeraseChainReaction模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

（一）PCR反應條件Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄（三）PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C1.目的基因的克隆2.基因的體外突變3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列測定5.基因突變分析（四）PCR的主要用途實時PCR技術原理目錄

三、核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的方法：化學裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)基本步驟將DNA的末端之一標記上放射性同位素（32P）再對DNA樣品分別進行多組具堿基特異的、隨機的不完全的化學修飾在修飾堿基位置化學法斷開DNA鏈通過具有可分辨長短僅一個核苷酸之差的PAGE電泳，將DNA斷裂片段按分子大小分開根據放射自顯影膠片上顯示的末端標記片段的分布情況，直接讀出DNA的核苷酸序列。

5'HO-GATCGGACCT3′↓標記5’32P-GATCGGACCT3′

↓不完全修飾修飾G修飾G和A修飾T和C修飾C↓化學裂解↓

電泳分離—G——G+A——T+C——C—全長核酸

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（三）DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現DNA序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反應產物經電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。DNA自動測序結果舉例目錄四、基因文庫

GeneLibrary基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。目錄第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結果舉例

五、遺傳修飾動物模型的建立及應用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel轉基因技術采用基因轉移技術使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細胞導入動物子宮，使之發(fā)育成個體。

轉基因——被導入的目的基因轉基因動物(transgenicanimal)——目的基因的受體動物（一）轉基因技術目錄核轉移技術—克隆動物

即動物整體克隆技術，將動物體細胞核全部導入另一個體的去胞核的受精卵內，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。（二）核轉移技術基因剔除技術也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內某種基因的技術。（三）基因剔除技術六、蛋白質相互作用研究技術

ResearchTechnologyofInteractionofProtein蛋白質之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復合物是細胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復制與轉錄、蛋白質的合成與分泌、信號轉導和代謝等等，都離不開蛋白質之間的相互作用。蛋白質之間相