遺傳學(xué)醫(yī)用5課件

Chapter9基因操作

（第一節(jié)、重組DNA技術(shù)基因工程第二節(jié)、基因文庫第三節(jié)、分子雜交及相關(guān)技術(shù)第四節(jié)、DNA多態(tài)1第九章重點(diǎn)內(nèi)容提示基因操作，重組DNA技術(shù),原理,步驟限制性內(nèi)切酶：命名、識(shí)別順序、切口（平末端，粘末端）基因載體（vector）,條件，常用載體基因探針，來源克隆(clone)探針標(biāo)記方法:nicktranslation(缺口平移)、隨機(jī)引物法DNA多態(tài)，RFLP，VNTR，STR，微衛(wèi)星DNAPCR方法、原理、應(yīng)用Southern–Blot:方法、原理、應(yīng)用Northern-Blot：方法、原理、應(yīng)用2

Chapter9基因操作

70年代以來,分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展起來,使人們有可能進(jìn)行人類基因組及單個(gè)基因的結(jié)構(gòu)研究,分析其功能特征,了解其變化規(guī)律。分子生物學(xué)技術(shù)為揭示人類遺傳病的本質(zhì)起著重要作用。下面就一些分子生物學(xué)技術(shù)予以介紹。3

第一節(jié)

重組DNA技術(shù)基因工程

重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技術(shù)。重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。

5

一、限制酶

限制性內(nèi)切核酸酶(restrictiveendonucle-ases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶。（“分子手術(shù)刀”）發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。61、限制酶的命名

根據(jù)其來源命名。如：

屬名

菌株名

EcoRI

種名

編號(hào)EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。795’－CTGCAG－3’3’－GACGTC－5’5’－GGATCC－3’3’－CCTAGG－5’5’－GATC－3’3’－CTAG－5’5’－GG3’－CCCC－3’GG－5’5’－GGCC－3’3’－CCGG－5’HaeⅢMboⅠBamHⅠPstⅠ5’－3’－CTAG－5’5’－GATC－3’－5’5’－G3’－C

CTAG

－5’5’－GATC

C－3’G－5’5’－CTGCA－3’3’－GG－3’3’－ACGTC－5’限制性內(nèi)切核酸酶10互補(bǔ)末端連接11產(chǎn)生相同序列的突出末端的不同片段

可有三種方式：

1)用同一種限制酶切割；2)用識(shí)別相同靶序列的不同限制酶切割；3)用識(shí)別不同靶序列但可產(chǎn)生一致的粘性末端的限制酶切割。133、特點(diǎn)：

根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn)，在基因工程和基因診斷中的重要用途：不論DNA的來源如何，同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可將不同種屬的DNA重組。如人和質(zhì)粒DNA等。用于人類基因組的DNA分析，具特定的酶切位點(diǎn)。Gene突變改變酶切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長度。應(yīng)用于限制性片段多態(tài)性分析。14二、基因運(yùn)載體及其選擇

載體（Vector）:將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。15（一）質(zhì)粒plasmid

Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

PBR322大腸桿菌pSC101

Plasmidchromosome

COIEIplasmid革蘭氏陰性菌pc194scp12真核生物-酵母質(zhì)粒

17常用的質(zhì)粒如pUC19，多連接子MCS。插入外源基因片段長度約10kb。將外源基因插入到MCS中，隨質(zhì)粒的表達(dá)而表達(dá)，增殖而擴(kuò)增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性喪失而不顯蘭色-白色菌落。如果不插入外源基因，則產(chǎn)生蘭色色。從而篩選陽性菌落。EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC1918

（二）.λ-噬菌體(λphage)是一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒,可高效感染大腸桿菌.λ-噬菌體DNA是線狀雙鏈DNA分子,全長約50kb,每條鏈各帶12bp長的單鏈互補(bǔ)末端-粘末端(COS序列)。進(jìn)入宿主細(xì)胞后不久，COS序列堿基配對(duì)環(huán)化?？砂b37~52kbDNA分子.改建后的λ噬菌體發(fā)展了多種較大型的克隆載體，如：19裂解途徑21（三）.粘粒(cosmidvector)（30~50kb）

是將質(zhì)粒和λ噬菌體改建的一種載體.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和cos末端。全長8kb。大片段外源DNA插入后，在體外包裝進(jìn)而被克隆。可包裝30~50kb長的DNA片段，多用于基因文庫構(gòu)建。

22(四)大片段DNA克隆載體

人類和哺乳動(dòng)物的基因組很大，甚至許多單個(gè)基因也相當(dāng)大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構(gòu)建的一些載體：BAC，PI，YAC等。232、噬菌體PI載體和PAC

PI噬菌體與λ噬菌體一樣，外有蛋白質(zhì)殼。內(nèi)含相當(dāng)大的（110~115kb）線性DNA，并在體外包裝于PI殼內(nèi)。PI進(jìn)入宿主細(xì)胞后環(huán)化，擴(kuò)增。1994年，有人將PI和F因子克隆結(jié)合產(chǎn)生PI人工染色體克隆系統(tǒng)PAC。253、酵母人工染色體

（yeastartificialchromosome,YAC）適用于克隆大片段DNA，0.2~2Mb。26三、DNA重組與分子克隆化

為獲得所需的基因或特異序列，需從細(xì)胞中分離得到目的基因與載體DNA重組，并用適當(dāng)方法在宿主細(xì)胞中表達(dá)，擴(kuò)增得到大量相同的DNA片段，稱為DNA克隆，亦稱分子克隆。29

基本原理與過程：

1、構(gòu)建重組DNA：分離純化目的基因目的基因+vector=重組DNA分子2、轉(zhuǎn)化：重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在其內(nèi)增殖。

3、細(xì)胞克隆的篩選:篩選含有重組DNA的細(xì)胞——細(xì)胞克?。╟ellclone），將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞至于瓊脂表面，以刺激細(xì)胞克隆生長，這些細(xì)胞是由單個(gè)細(xì)胞形成的遺傳相同的細(xì)胞群體，故稱細(xì)胞克隆。再將每個(gè)克隆移至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。4、分離重組DNA克?。杭词斋@擴(kuò)增的培養(yǎng)細(xì)胞，并選擇分離重組DNA。

30分離純化目的基因

目的基因+vector=重組DNA分子

31vectorrestrictionendonuclease重組DNA技術(shù)流程簡圖foreignDNAbacterialcell32ligase重組DNA技術(shù)流程簡圖vectorrestrictionendonucleaseforeignDNAbacterialcellhost33重組DNA

和分子克隆

34重組DNA和分子克隆的幾種方法：

1、從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克??；2、由特定mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行克隆3、化學(xué)合成目的基因進(jìn)行克隆4、PCR體外擴(kuò)增目的片段進(jìn)行克隆35篩選含有重組DNA的細(xì)胞——細(xì)胞克隆（cellclone）

36篩查含有目的基因的細(xì)胞克隆37從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆

3839四、目的基因表達(dá)

上述細(xì)胞的克隆系統(tǒng)可直接導(dǎo)入的目基因擴(kuò)增，獲得足夠量的目的基因來進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的研究。

重組DNA技術(shù)的另一目的是獲得基因重組后的產(chǎn)物——RNA，蛋白質(zhì)。就是將目的基因與表達(dá)載體重組(含激動(dòng)子)，導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)出相應(yīng)的基因產(chǎn)物（蛋白）。如胰島素，干擾素；生產(chǎn)疫苗的抗原和特異的抗體等。此類克隆系統(tǒng)稱為表達(dá)克?。╡xpressioncloning）.40目

的

基

因

表

達(dá)

41（一）．真核細(xì)胞的基因在原核細(xì)胞（細(xì)菌）中表達(dá)

原核細(xì)胞中缺乏真核基因表達(dá)裝置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表達(dá)。通常采用大腸桿菌為宿主。真核多肽的表達(dá)要求：1）適當(dāng)?shù)腸DNA（完整的編碼序列）；2）適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，提供特定多肽信息；3）外部進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)有啟動(dòng)子。

產(chǎn)物特征：1）真核細(xì)胞的蛋白由于不能羥基化而不穩(wěn)定；2）活性受限或無活性。42(二)、真核細(xì)胞基因在真核細(xì)胞中表達(dá)

真核宿主細(xì)胞提供一個(gè)相似但又不相同的環(huán)境。常采用酵母或昆蟲細(xì)胞作為宿主。應(yīng)用于真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的大量制備，研究特定基因的表達(dá)。產(chǎn)物翻譯后羥基化，羧基化等，有加強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定和功能活性。43第二節(jié)、基因文庫

基因文庫（genelibrary）應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的含有基因組的全部基因的克隆。44一、構(gòu)建基因組DNA

文庫45

ConstructionofagenomiclibraryofhumanDNAinabacteriophageλvector

46二、染色體特異的基因文庫

（chromosomespecificlibrary）

單個(gè)染色體:

細(xì)胞克隆

（流式C儀）↓細(xì)胞

染色體染色體文庫

染色體區(qū)帶:

區(qū)帶特異（顯微切割）↓

DNA文庫

47

三、cDNA文庫（cDNAlibrary）

cDNA文庫構(gòu)建：

特定組織細(xì)胞一定發(fā)育階段

總mRNA48第三節(jié)

分子雜交及相關(guān)技術(shù)

分子雜交（molecularhybridization）,標(biāo)記的探針DNA變性后與變性后的靶DNA/RNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，形成雜種分子的過程。

分子雜交包括：DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交及蛋白雜交等。

49分子雜交的目的就是運(yùn)用特異的探針鑒定復(fù)雜的靶DNA中同源的DNA片段。

雙鏈probe或DNA解鏈，主要取決于：1．鏈的長度：鏈越長，需要的能量多才能解鏈；2．堿基成分：GC含量高，較難變性；3．化學(xué)環(huán)境：單價(jià)陽離子穩(wěn)定雙鏈，甲酰胺，尿素破壞雙鏈50一、基因探針（geneprobe）是指與一段目的基因或DNA/RNA片段特異雜交的核苷酸序列。Probe可以是整個(gè)基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。DNA探針(DNAprobe)RNA探針(RNAprobe)寡核苷酸探針(oligonucleotideprobe)單一EST探針(uniqueESTprobe)51（一）.探針的種類與制備

1、基因組探針：從已建立的基因組文庫中篩選和分離所需的目的基因。克隆

擴(kuò)增

大量的DNA探針52DNA克隆532、cDNAprobe:從已構(gòu)建的cDNA文庫中篩查和分離目的基因探針。

543、寡核苷酸probe:

克隆（clone）:是指用無性繁殖的方法獲得同一個(gè)體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。根據(jù)已知基因序列合成一段互補(bǔ)的DNA片段。一般長約15~50個(gè)bp。多數(shù)探針的制備都通過分子克隆的方法獲得。

55（二）探針的標(biāo)記

將探針標(biāo)記上一種標(biāo)識(shí)物以便雜交后檢測。

常用于標(biāo)記探針的標(biāo)識(shí)物：同位素：32P

,35S

,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。

常用的標(biāo)記方法：561、缺口平移法（NickTranslation）原理及過程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I5’3’外切酶活性，在缺口處按5’3’方向切除單核苷酸；同時(shí)DNA聚合酶I有5’3’的聚合酶活性，在缺口處3’端加入底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記單核苷酸，并被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。

57NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP

Bio-dNTP582、隨機(jī)引物法（6核苷酸引物標(biāo)記法）

原理及過程：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5’3’聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3’端為起點(diǎn)，沿模板3’5’方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中，探針即被標(biāo)記。59隨機(jī)引物標(biāo)記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP變性-復(fù)姓603、DNA末端標(biāo)記61二、DNA雜交常用的方法

（一）.Southernblot

1975年，英國科學(xué)家Southern首創(chuàng)，是指DNA-DNA雜交，是經(jīng)典的基因分析方法。

1、原理和步驟:提取T、CellDNA限制酶消化DNA片段電泳分離變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜變性、雜交洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析62SouthernBlot63-+Southernblot探針642、應(yīng)用:

(1).基因組結(jié)構(gòu)分析：

如缺失、插入、倒位等的檢測(2)RFLP連鎖分析65(二).斑點(diǎn)雜交(dotandslothybridization)

鑒定核酸序列的簡便方法。1、原理及步驟：提取T、CellDNA↓點(diǎn)樣品至膜、干燥、固定↓探針、DNA變性、雜交↓洗膜、放射自顯影↓結(jié)果分析

66DNA

樣品

2、應(yīng)用：1）混合樣品DNA鑒定2）基因缺失檢測3）基因表達(dá)分析

點(diǎn)樣Probe-32P檢測AB123467（三）等位基因特異性寡核苷酸探針雜交（allele-specific-oligonucleatide,ASO）

該技術(shù)應(yīng)用于當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明確，可以合成ASO探針。探針通常為20bp左右，標(biāo)記后用于雜交檢測。檢測點(diǎn)突變時(shí)一般需合成兩種探針：設(shè)計(jì)：正常探針5’-AGT-3’與正常基因序列雜交穩(wěn)定；

突變探針5’-AAT-3’與突變基因序列雜交穩(wěn)定；PCR技術(shù)可結(jié)合ASO，即PCR-ASO技術(shù)，以ASO探針檢測擴(kuò)增后的產(chǎn)物——突變基因檢測。68例:PKU產(chǎn)前診斷正常探針突變探針12ⅠⅡ12Ⅱ2進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷結(jié)果分析Ⅱ2為正常個(gè)體69三、Northernblot

是指DNA-RNA分子雜交，應(yīng)用特異性基因探針分析基因的轉(zhuǎn)錄水平。1.原理及步驟：提取T、Cell總RNA↓提純分離mRNA↓瓊脂糖凝膠電泳分離RNA↓轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜↓雜交檢測70NortherBlot71

2、應(yīng)用：

（1）檢測mRNA長度分子量大?。ㄒ离娪具w移率估計(jì)）；（2）mRNA的含量，即基因表達(dá)高低。（密度掃描儀，定量分析）

72四、Westernblot

是蛋白水平檢測，研究基因表達(dá)與功能的一種方法。原理及步驟Torcell提取蛋白

聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白

（SDS)轉(zhuǎn)移（印跡）于硝酸纖維素膜

加抗體檢測某種特異性蛋白質(zhì)73WestBlot74Westernblot生物素HRP化學(xué)顯色復(fù)合物ABC復(fù)合物組織抗原抗生物素一抗生物素化二抗抗HRP75五、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。KaryB.Mullis7677PCR78ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3:Extension延伸72°CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA79原理：1)合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴(kuò)增片段的長度；2)反應(yīng)體系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer3)反應(yīng)程序：

變性(94~95oC)

復(fù)性

延伸(37~55oC)(70~72oC)72oC延伸10min30-35cycles

DNA擴(kuò)增100萬倍80PCR擴(kuò)增81PCR特點(diǎn)及應(yīng)用：優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定可靠、快速；

（2）微量的模板DNA即可擴(kuò)增大量產(chǎn)物。應(yīng)用：（1）基因組DNA分析；

（2）遺傳物質(zhì)的鑒定；

（3）遺傳病的診斷。缺點(diǎn)：（1）需靶DNA序列的信息；

（2）產(chǎn)物短小，DNA復(fù)制不精確。82PCR相關(guān)技術(shù)：

1）增效PCR（boosterPCR）當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問題：

一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增.消耗了引物和酶，而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成產(chǎn)物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15~20個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充引物量，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。832)巢式PCR（nestPCR）此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR，與上面不同的是，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。84在同一PCR體系中加入若干對(duì)PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。多重PCR常用來檢測同一基因的多個(gè)外顯子的缺失，或在檢測缺失設(shè)置內(nèi)對(duì)照。3)多重PCR

854）RT-PCR

RT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速擴(kuò)增（達(dá)ng~μg水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控的研究。86RT-PCR87RT-PCRcDNA88六、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SingleStrand

ConformationPolymorphism,SSCP）

是指單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同。據(jù)此，可用于DNA中單個(gè)堿基的替代，微小的缺失或插入的檢測。通常與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)。在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳（中性膠），突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而作出判斷。89PCR-SSCP過程：

primer

32P-dNTP摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

變性

單鏈DNA

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

12345自顯影1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者3.為雜合子

.

解鏈構(gòu)像DAN原理過程90PCR-SSCP過程91七、DNA測序（Sequencing）Sanger法9293949596第三節(jié)

DNA多態(tài)

DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：DNA區(qū)域中等位基因(或片段)存在兩種或兩種以上形式,對(duì)基因沒有影響,稱為DNA多態(tài)。群體中每個(gè)個(gè)體（體細(xì)胞）的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100~500bp就有一個(gè)是不相同的，它們多位于內(nèi)含子序列中，表型并沒有改變，這種表現(xiàn)稱為DNA多態(tài)。除一卵雙生子外，沒有兩個(gè)個(gè)體的基因組DNA是完全相同的。

常用做遺傳分析中的標(biāo)記遺傳標(biāo)記97DNA分析中常用的多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性：短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3）單堿基多態(tài)性（SNP）：DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。98一、序列多態(tài)（或點(diǎn)多態(tài)）限制性片段長度多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。