最詳細(xì)系統(tǒng)原理應(yīng)用及發(fā)展

最詳細(xì)系統(tǒng)原理應(yīng)用及發(fā)展第1頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1基因修飾的方法與各自優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒-瞬時(shí)轉(zhuǎn)染-某些細(xì)胞效率偏低-表達(dá)結(jié)果不穩(wěn)定，有內(nèi)源表達(dá)的干擾；質(zhì)粒-穩(wěn)定細(xì)胞-表達(dá)結(jié)果不穩(wěn)定，篩選效率不高，在重組插入基因組中可能干擾其它基因表達(dá)；病毒-瞬時(shí)感染-表達(dá)結(jié)果不穩(wěn)定，質(zhì)粒容易在細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中丟失，隨機(jī)插入基因組中可能會(huì)干擾其它基因表達(dá)；新一代的基因編輯技術(shù)-利用重組酶在基因組水平修飾基因，產(chǎn)生的遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，直接作用于內(nèi)源，減少表達(dá)干擾，目前有成熟的技術(shù)如CRISPR/Cas9；第2頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五DNANHEJandHDRDNAsequencedisruptedNHEJ:Non-homologousendjoining+donorDNADNAsequencereplacedHDR:homologydirectedrepairDNA修復(fù)的機(jī)制與基因編輯原理非同源性末端接合修復(fù)機(jī)制(Non-homologousendjoining,NHEJ)同源介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制(Homology-directedrepair,HDR)第3頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五ZFNandTALENZFN與TALEN基因編輯原理4第4頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五I:GenomemodificationII:GenomicdeletionLeC,FAnnR,DavidC,etal.2013,Science,(6121):819-823.GenomeEditinginMammalianCells5第5頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五DumpiernematodesZebrafishembryosFruitfliesPennisiE.2013.Science,(6148):833-6.RiceModelsgeneratedbyCRISPR/Cas9systemMonkey6第6頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1CRISPR-Cas概述1987年，日本大阪大學(xué)（OsakaUniversity）在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。2013以后，研究者們?cè)诎ā秙cience》和《naturebiotechnology》等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。第7頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1CRISPR-Cas概述CRISPR-Cas：一種來(lái)源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。第8頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五CRISPR-Cas主要由兩部分組成：識(shí)別切割1CRISPR-Cas概述第9頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.1CRISPR結(jié)構(gòu)CRISPR：（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）

CRISPR是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族,廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats)組成,重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常21~48bp,重復(fù)序列之間被26~72bp間隔序列(spacer)隔開。CRISPR就是通過(guò)這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。第10頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.1CRISPR結(jié)構(gòu)第11頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.2Cas家族Cas（CRISPRassociated）：

存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guideRNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。第12頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識(shí)別，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。第13頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)第14頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)第15頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對(duì)外源DNA特異性免疫,而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對(duì)自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由CRISPR間隔序列的動(dòng)態(tài)性變化，即通過(guò)增加或刪除間隔序列（spacer）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。第16頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：PAM（protospacer-adjacentmotif）為NGG。第17頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)NGGPAM。第18頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求第19頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾第20頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.1dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換2013年1月29日在《nature

biotechnology》上發(fā)表的《RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來(lái)達(dá)到基因的定向修飾。第21頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.1dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換第22頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.2sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾2013年1月29日在《nature

biotechnology》上發(fā)表的《efficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem》一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對(duì)斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。第23頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.2sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾第24頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.2sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾第25頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.2sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾Cas9sg-RNA第26頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2013年2月15日在《science》上發(fā)表的《MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems》一文中，作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的spacers的crRNA實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。3.3cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾

第27頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五3.3cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾

第28頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項(xiàng)極具有可能獲得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)。第29頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析2013年4月12日在《cellstemcell》上發(fā)表的《EnhancedEfficiencyofHumanPluripotentStemCellGenomeEditingthroughReplacingTALENswithCRISPRs》一文中，作者利用TALENs和CRISPRs對(duì)同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為0%-34%和51%-79%。第30頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來(lái)說(shuō)，CRISPRs比TALENs更容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個(gè)核苷酸就行。第31頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五4CRISPR-Cas只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。編碼sgRNA的序列不超過(guò)100bp，因此比構(gòu)建TALENs和ZFNs更簡(jiǎn)單方便。較短的sgRNA序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來(lái)的并發(fā)癥。技術(shù)優(yōu)勢(shì)第32頁(yè)，共33頁(yè)，2023年，2月20日，星期五5我們的工作