大腸桿菌培養(yǎng)操作規(guī)程

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一、目的及適用范圍

制訂本規(guī)程的目的為規(guī)范大腸桿菌總RNA的制備，保證為診斷試劑產(chǎn)品提供質(zhì)量可控的質(zhì)控品及標(biāo)準(zhǔn)品基質(zhì)。本規(guī)程適用于南京試驗(yàn)室提取大腸桿菌總RNA的操作。依照本操作規(guī)程，每次可提前大約提取基質(zhì)液原液2.7ml。

二、常規(guī)時(shí)間安排預(yù)計(jì)安排步驟耗材準(zhǔn)備PBS儲(chǔ)存液配置第一天培養(yǎng)基配制滅菌領(lǐng)取菌種菌種復(fù)蘇其次天接種分裝培養(yǎng)RNA完全提取根據(jù)需求，自行安排。

三、培養(yǎng)用耗材準(zhǔn)備

1、錐形瓶、雙層鋁箔、棉繩

2、包扎一盒1ml的槍頭，50ml康寧凍存管

四、培養(yǎng)基配制(早上)

培養(yǎng)基應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，每次配置350ml，一次性使用完畢。

1、按下表稱取物資配置LB培養(yǎng)基到500ml錐形瓶中：例如：配制350mlLB培養(yǎng)基配方如下：[配置雙份]蛋白胨成分名稱TRYPTONE稱取質(zhì)量3.5g鈉3.5gYEASTXTRACT1.75g補(bǔ)足350ml氯化酵母提取物去離子水耗時(shí)評(píng)估20min40min20min3h10min9h40min13h2、用雙層鋁箔和棉繩對(duì)錐形瓶進(jìn)行封口，晃動(dòng)錐形瓶以使各物質(zhì)迅速、均勻、

完全、溶解。待滅菌。

五、PBS溶液配制

1、10XPBS不需要每次生產(chǎn)都配置，生產(chǎn)前跟檢查PBS量是否充足，如充足

則可跳過(guò)該步驟。

2、配制10XPBS緩沖液備用；例如配制1000L10XPBS儲(chǔ)存液，取1000ml配

液瓶，根據(jù)下表稱取各物質(zhì)。用去離子水定容至1000ml。

名稱濃度H2ONaClKClNa2HPO4KH2PO4稱取量10X1000ml80.0g2.0g14.4g2.4g3、將PBS溶液混合均勻，包扎好，待滅菌。

六、滅菌

1、將配置好的PBS溶液，培養(yǎng)基，1ml槍頭準(zhǔn)備好。

2、確認(rèn)滅菌鍋內(nèi)水位是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)水位，若未達(dá)到，則參與純化水至標(biāo)準(zhǔn)水

位。

3、將包扎好的培養(yǎng)基、PBS溶液和槍頭盒一同放入滅菌鍋。注意PBS蓋不可

太緊，蓋緊滅菌鍋蓋，須旋緊；設(shè)置各參數(shù)：121℃，20min。

4、滅菌終止后，待滅菌鍋壓力降至“0〞，開啟滅菌鍋蓋；取出滅好菌的培養(yǎng)

基和槍頭盒。

5、PBS、培養(yǎng)基放置于室溫靜置2h，待完全冷卻。槍頭盒放入80°C鼓風(fēng)干

燥箱三小時(shí)烘干。備用。

6、冷卻至室溫后，進(jìn)行活化。

七、菌種復(fù)蘇（下班前）

1、開啟超凈工作臺(tái)紫外燈，紫外照射半小時(shí)，關(guān)閉紫外燈。

2、在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行菌種復(fù)蘇接種操作，開啟50ml凍存管管蓋后，用酒精

燈外焰灼燒滅菌處理凍存管管口，開啟處理好的培養(yǎng)基瓶，用酒精燈外焰灼燒滅菌處理培養(yǎng)基瓶瓶口，倒10ml培養(yǎng)基至50ml凍存管中，用酒

精燈外焰灼燒滅菌處理培養(yǎng)基瓶瓶口后將培養(yǎng)基瓶密封待用。0

3、吸取400μL菌種到已加培養(yǎng)基的50ml凍存管中，用酒精燈外焰灼燒滅菌

處理凍存管管口后蓋好凍存管管蓋，震蕩混合均勻。

4、標(biāo)記凍存管，并培養(yǎng)：恒溫培箱，恒溫培養(yǎng)8h，設(shè)置參數(shù)：37℃，220r/min。

八、接種（其次天早上）

1、提前半小時(shí)開啟超凈工作臺(tái)紫外燈，紫外照射半小時(shí)，關(guān)閉紫外燈。2、在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行接種操作，在開蓋后及封蓋前均須將瓶口或管口用酒

精燈灼燒滅菌處理。

3、接種量為：1:100。例如：300ml培養(yǎng)基，取出DH5α菌種瓶，開啟后用酒

精燈外焰旋轉(zhuǎn)焰灼燒瓶口滅菌，吸取3mlDH5α菌種參與到培養(yǎng)基中，用酒精燈外焰旋轉(zhuǎn)灼燒菌種瓶口滅菌后蓋好蓋子，用酒精燈外焰旋轉(zhuǎn)灼燒培養(yǎng)基瓶口滅菌后蓋好蓋子，搖勻接種后的培養(yǎng)基。

4、接種操作終止后，