大腸桿菌中胞外分泌N糖蛋白的生產(chǎn)

/大腸桿菌中胞外分泌Ｎ糖蛋白的生產(chǎn)ＡdamＣ.Fisｈer,１CharｌesH.Ｈａitｊema,2?CasｓandraGuaｒino,3，4?ＥｄaC?eｌik,3?ChristineE.Endiｃotｔ，３?CｒaｉgA.Ｒｅadiｎg,1ＪuｄiｔhH．Merriｔt,１A．CelesteＰtak，5ShｅｎgＺｈａnｇ，５andMaｔtｈeｗＰ。DeＬisa2,３,4*摘要空腸彎曲菌(Cａｍpylobａcterｊeｊuni）的pgl基因組編碼的一個(gè)完整的Ｎ蛋白糖基化的途徑，這個(gè)途徑能官能地移到大腸桿菌上去。在這個(gè)系統(tǒng)中,我們分析N糖基化,細(xì)菌中膜遷移和受體蛋白折疊之間的相互作用。我們開發(fā)了一個(gè)重組N–聚糖受體肽標(biāo)簽，允許不同的重組蛋白的N—糖基化，蛋白質(zhì)在能糖基化大腸桿菌分子的周質(zhì)中表達(dá)。用這種糖基化標(biāo)簽，一個(gè)明顯不同之處在糖基化模型中被觀察到了，周質(zhì)蛋白決定了內(nèi)膜遷移的模型(i。ｅ。,Sec,信號識別顆粒[ＳRP］,或雙精氨酸遷移［TAT]導(dǎo)出)，這種現(xiàn)象表明蛋白質(zhì)導(dǎo)出方式可以影響N-糖基化效率。我們也建立工程培養(yǎng)基蛋白定位到周質(zhì)外的環(huán)境，比如外膜，膜囊,和細(xì)胞外培養(yǎng)基，這些可以作為N糖基化培養(yǎng)基。兩者合計(jì)，我們的結(jié)果表明，空腸彎曲菌N—糖基化的組織與大腸桿菌中的不同的分泌機(jī)制是親和的，有效擴(kuò)大重組大腸桿菌N–糖組。此外,這個(gè)簡單的糖基化標(biāo)簽策略擴(kuò)大了糖工程工具箱和打開了細(xì)菌合成一大批重組糖蛋白結(jié)合物的大門.前言天冬酰胺連接(N連接）蛋白糖基化是至關(guān)重要的且保留在真核生物有機(jī)體中。它是最普遍的所有蛋白質(zhì)翻譯后修飾，影響到近70％的真核蛋白質(zhì)組。結(jié)合到真核分泌和膜蛋白上的聚糖附屬物可影響蛋白的折疊和穩(wěn)定性,齊聚，抗水解，排序，和運(yùn)輸。Ｎ-連接的糖基化發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER）中且涉及到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂質(zhì)載體上多糖的裝配,其次是轉(zhuǎn)移到特定的天冬酰胺殘留的目標(biāo)多肽上.最初，Ｎ–連接糖基化只發(fā)生在真核生物中。然而，N-糖蛋白現(xiàn)在已經(jīng)被描述到生活的所有領(lǐng)域，包括古菌和最近的細(xì)菌，其中最具特征的例子是人類胃腸菌空腸彎曲菌(Ｃａmpｙｌｏbａｃterｊｅjｕni）。在空腸彎曲菌中,參與這個(gè)途徑的基因組包括一個(gè)17—ｋb命名為pgl的蛋白糖基化基因。迄今,超過4０種周質(zhì)和膜糖蛋白已被確定為空腸彎曲菌，且大多數(shù)這些綁定到N-乙酰半乳糖胺(ＧａlＮAc)-特效血凝大豆凝集素（ＳBA）。質(zhì)譜和核磁共振共振(NMＲ）的研究顯示,Ｎ連接聚糖就是GlcGaｌNAc５Ｂａｃ，這里Bac是細(xì)菌糖胺（2，４—二乙酰氨基—2，４，6－三脫氧葡萄糖）。這個(gè)分支七糖通過按次序添加在脂質(zhì)載體上的激活核苷酸糖以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜表面的十一碳烯焦磷酸酯來合成.一旦裝配完，脂連的七糖通過假定的ＡＴP結(jié)合盒(ＡBC）運(yùn)輸人PgｌK快速翻轉(zhuǎn)通過膜.七糖通過一種叫PglB的寡糖傳輸酶(OＳＴ)催化轉(zhuǎn)移到了周質(zhì)培養(yǎng)基蛋白上。Ｐg(shù)ｌＢ是單個(gè)完整的膜蛋白，和催化真核亞基ＯSTＳTT３有明顯的順序相似性。PｇlB把七糖固定在天冬酰胺酸上，以D/E－X1－Ｎ－X2-S／T為基本圖案（在這里X1，X2是除脯氨酸外的任意殘基)，一種相似于真核細(xì)胞糖基化位點(diǎn)的位點(diǎn)。近期Waｃker和合作者把整段空腸彎曲菌（Ｃ．ｊeｊunｉ）pgl基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌上,賦予這些分子使蛋白質(zhì)糖基化的能力。天然空腸彎曲菌（C.jｅｊｕni)糖蛋白例如Peb3和AcrA能通過Sec途徑定位到周質(zhì)，在具有糖基化能力的大腸桿菌中N糖基化。AcｒA通過雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(Taｔ)運(yùn)輸時(shí)也能N糖基化,Tat途徑因?yàn)槟芡ㄟ^內(nèi)膜導(dǎo)出折疊蛋白的能力而眾所周知。除了周質(zhì)蛋白，一些天然空腸彎曲菌(C.jｅjuni）N-糖蛋白基于生物信息分析被預(yù)測為完整的膜蛋白.共同的，這些早期的研究表明空腸彎曲菌（C.jeｊｕni)N—連接糖蛋白組織與不同的分泌機(jī)理親和，能容忍從不折疊多肽到完整折疊蛋白域（雖然高度復(fù)雜且溶劑暴露）。然而受到膜遷移和細(xì)菌上受體蛋白折疊的影響，糖基化還沒有被完全完成。定位到周質(zhì)外的蛋白，例如外膜或細(xì)胞外培養(yǎng)基是否與N糖基化親和還不知道.因此，本文的目的在于研究不同分泌和細(xì)胞外蛋白培養(yǎng)基在帶有pgl基因大腸桿菌分子中N糖基化的程度.為了解決這個(gè)問題,我們開發(fā)了一種基因編碼N聚糖受體多肽標(biāo)簽(GT),它能附加在末端或植入重組蛋白內(nèi)部位置。許多用GT來修飾的重組蛋白在表達(dá)ｐgl基因的大腸桿菌菌株中可靠地被糖基化了。當(dāng)GT被用來和通過不同輸出途徑(e．g。，Sec，信號識別顆粒［SRP]，或Ｔat）定位到周質(zhì)上的蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在糖基化模型中的一個(gè)明顯不同之處,這取決于他們在內(nèi)膜上遷移的模式。在所有測試的事例中,通過GT的N聚糖附屬物沒有對蛋白質(zhì)活性產(chǎn)生任何可測量的影響.最后我們發(fā)現(xiàn)定位到不同位點(diǎn)的蛋白質(zhì)是很容易被N糖基化的,這些位點(diǎn)包括周質(zhì),外膜,膜囊和細(xì)胞外培養(yǎng)基.材料和方法細(xì)菌菌種和生長條件所有這個(gè)研究用到的菌種都在表1中列舉了。大腸桿菌DH５α用作質(zhì)粒的克隆,大腸桿菌菌株ＣＬＭ2４（16)用在所有糖蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)中除非特別標(biāo)記。由于分子表面糖蛋白的標(biāo)記，大腸桿菌菌株BW2511３?waａL：：Kan被使用(3)。為了外膜膜囊的準(zhǔn)備,大腸桿菌菌株CE8０３2通過P１vir噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)來生產(chǎn)。簡單來講，卡那霉素標(biāo)記的等位基因能在受體分子JC80３1中轉(zhuǎn)導(dǎo),其中ＪC80３1是一種有很多小泡的tolRA的突變菌株,等位基因能從BW２5113?ｗａａＬ：:Kａn中得到。由于YeｂＦ影響分泌研究，MC41００菌株由于有最小的麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）漏損率而被使用,其中有1５個(gè)普通的大腸桿菌菌株被測試，其中一個(gè)衍生菌株在它早期成長階段沒有MＢP漏損率。晚上大腸桿菌要用新鮮的Luria-Ｂeｒtaｎi（LＢ）培養(yǎng)基來稀釋,再加抗生素和0。2％葡萄糖，在３0℃或37℃下培養(yǎng)。在對數(shù)中期時(shí)(光密度在600nｍ)，培養(yǎng)基換成了沒有葡萄糖且含有抗生素的LＢ溶液，蛋白質(zhì)的表達(dá)受到1０0μM異丙基-β-D—硫代半乳糖-吡喃糖苷(IＰTＧ)pＴrc99Ａ-基質(zhì)表達(dá)載體或0．2%阿拉伯糖ｐB(yǎng)ＡD基質(zhì)表達(dá)載體的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)反應(yīng)在２5℃或３0℃下持續(xù)24h?？咕赜靡韵聺舛?100μg/ml氨芐青霉素（Amp),２5μg/ｍl氯霉素(Cm），和50μg/mlKan。質(zhì)粒構(gòu)造質(zhì)粒pＴrc-GT-6Х－Ｈis是以植入合成的DＮA來克隆的,該DＮA編碼GＴ(集成DNA技術(shù)[ＩDT]）和一個(gè)在XbａI和HinｄIIIpTRC99A之間的六—His(6Х—His）主題.DNＡ編碼mａlE,?spｍalE（在那ｓｐ代表信號順序/多肽），sptorA－ｍａlE，spdsbＡ-malE和spmalE被分別植入到SacI和ＸｈｏIofpTｒc—GＴ-6Х-His來制造ｐTrｃ—MBP-GT，pTｒｃ—?spMBP-GＴ,pＴｒc—spTorＡ-MBP—ＧＴ，ｐTｒｃ－spＤｓbＡ－ＭBP-GT,和pTrc－sｐMＢP-GT.編碼?sｐmaｌE的DＮA被克隆進(jìn)pTrｃ—spMＢP-ＧT的SalI位點(diǎn)來制造pTｒｃ-ｓpＭBP—GＴ－MBＰ。編碼GT-MBP的ＤNA然后被克隆回SacI和AｆｅI位點(diǎn)的ｐＴｒｃ-ＭＢP－GT來制造ｐＴｒc—spＭBP-GT—MBP—ＧＴ.編碼Top7的DNＡ被克隆進(jìn)ｐＴｒc—ｓｐDsbＡ—MBP-ＧT的XｂaＩ和ＸhoＩ位點(diǎn)來制造pＴｒｃ-spDsｂA—TOP7－GT.編碼sptorA-gfpmut2的DNＡ被克隆進(jìn)ｐTrc—ＧT－６Х－His的SacI和BamHI位點(diǎn)來制造pTrｃ-spTｏrA－ＧＦP－GT。編碼２６.10IｇG重鏈和輕鏈雙版本的DNＡ通過pMAZ３60—26.10的PCR擴(kuò)大來得到且通過AvrＩI和SpeI消化。ＰCR產(chǎn)品被克隆進(jìn)pTrｃ－spDsbA-TOＰ７－GT，ｐTrｃ—spDsbＡ—TＯP7-ＧT已經(jīng)被XbaI和ＳpeI切斷來移動Tｏp7編碼的基因。最終的質(zhì)粒是pＴrc-spDsbA-２6.10LC－sｐＰelB－26。10HC-GT，表達(dá)帶有DsbA信號肽的輕鏈，帶有PelB信號肽的重鏈和一個(gè)C－終點(diǎn)的ＧT。ｐTrc—spＤｓbA—Fｃ質(zhì)粒通過克隆人類IgG1的Ｆc區(qū)變成ｐTrc－spＤsbA-MＢＰ—GT的XｂａＩ和HindIII來制造。pTｒc－spDsbA-FcＤQＮAT質(zhì)粒也用相同的方法來制造，除了Fｃ基因，F(xiàn)c基因編碼Q295D，Ｙ２96Ｑ和Ｓ29８A的點(diǎn)突變且通過在SaccharoｍyｃesCerevｉsiaｅ中的同性質(zhì)重組克隆進(jìn)pMQ７0（49）然后克隆進(jìn)ｐTrc—ｓpＤsbA－MＢP－ＧＴ的XbaI和ＨindＩII位點(diǎn).質(zhì)粒pBAD18－CjａA通過放大來自C。jeｊuni的cjaＡ基因來制造(由ＢrｅndanＷren提供)。cjaA的PCR放大在質(zhì)粒pBAD１８的NcoI和NotＩ位點(diǎn)被克隆，包括在NoｔI和PｓiI之間的旗表位末端。質(zhì)粒ｐＢAD２4-OmｐX-GT通過植入在質(zhì)粒pＢAD２4－OｍpＸ＊—HisKｐnI和SｐeI位點(diǎn)的GT順序來制造（在這里＊表示一個(gè)ＯmｐX的突變形式，OmpX包含包含一個(gè)植入多肽到loｏp２的克隆位點(diǎn))這樣的ＧＴ多肽末端定位在絲氨酸殘基OmpＸ的細(xì)胞lｏop2外的５3和54號位。這跨膜循環(huán)能夠容忍短肽插入不影響Ｏｍpx表面表達(dá)(44）。一個(gè)在KpnI和SpeI位點(diǎn)側(cè)面的GQSGＱ鍵也被產(chǎn)生了。一雙順反子結(jié)構(gòu)的共表達(dá)OmpX－ＧT和PglB的是由放大pgｌＢ從空腸彎曲桿菌的基因組DＮＡ,并插入得到的PＣR之間的產(chǎn)品XbaＩ和SBFI的質(zhì)粒pBAD24。接下來，OmpX－ＧTNcoⅠ位和XｍaⅠ之間插入在相同的質(zhì)粒，但用其自己的核糖體結(jié)合位點(diǎn)相同的一個(gè)上游的pglＢ。質(zhì)粒pBＡD18－ClyA—GＴ構(gòu)建成ｐTrｃ-GT-6Х－Hiｓ通過第一插入的ＰCＲ—amｐlifiedclｙA基因-Hｉs的SacI和XhｏI位之間。整個(gè)CｌyA－ＧT－6Х-His，它的結(jié)構(gòu)是通過PCR擴(kuò)增和插入之間的SａcI和HiｎｄIIＩ位點(diǎn)在pBＡＤ18。ＹebF質(zhì)粒pTrｃ99A的衍生物。對于這些，Ｅ。大腸桿菌一套YebＦPCR擴(kuò)增并克隆在pＴrc9９Ａ的SacⅠ和XbaⅠ位之間。對照組同樣由克?。賓ｂF的N－末端信號肽（spYebF)或構(gòu)造運(yùn)用于大腸桿菌表現(xiàn)系統(tǒng)的YｅbF缺乏成熟的域的N—末端信號肽（?sｐYebF）SacＩ和XbａＩ位于pTrc９9A上。GT或MＢP—ＧT的融合,再加入每個(gè)YｅbＦＸbaⅠ和SalⅠ位點(diǎn)之間,SalⅠ和ＨinｄⅢ位點(diǎn)之間插入。本研究質(zhì)粒的序列的所有構(gòu)建的DNA測序被證實(shí)。工程蛋白質(zhì)溶液內(nèi)消化在溶液中消化MBP－ＧT進(jìn)行如前所述(63)無還原和烷基化反應(yīng)。A蛋白樣品(2０0克）溶解在總量為100升變性溶液含有6.0ＭＨCl和50毫摩爾Tｒｉs,pH值為８．0,并孵育在56℃下為4５分鐘。樣品1:5稀釋于5０mM乙酸銨碳酸氫鹽，pＨ值7.8.然后,以10克胰蛋白酶(Ｐｒoｍｅga)或1克的lyｓC（西格瑪)被添加到的ＭBP－ＧT或AＣＲＡ—4（ＡＣRA含有四種可能的糖基化位點(diǎn)）的溶液，分別在的酶—底物的比率為1：20(重量/重量）。蒸煮16小時(shí)在37℃下進(jìn)行,并停止通過加法為0.5%（體積／體積)的三氟乙酸（TFＡ)。摘要脫鹽固相萃取使用的是9月包裝盒(Wａt(yī)erｓ公司），并洗脫的胰蛋白酶肽,蒸發(fā)至干，用ＳｐeedVac離心SC110。將樣品重新溶解在200升含0.１%甲酸的用2%乙腈得到20pmol／μl的儲備液。納米噴射的質(zhì)譜分析MBP－ＧT進(jìn)行了分析，輸注納升電質(zhì)譜（ＭS)分析如下。酶分析在2pmｏｌ/μl的濃度在50%乙腈稀釋樣品中。MS分析之前，用0。１％甲酸。將樣品(6升）裝入一個(gè)獨(dú)立的玻璃尖(交付的ＬＴQOrbiｔｒaｐXL配備了一個(gè)納米級的離子源質(zhì)譜儀.該示例一項(xiàng)調(diào)查顯示MS掃描和分析，調(diào)整和正離子模式，串聯(lián)質(zhì)譜（ＭS/MS)的掃描選擇的離子使用的Orｂitrap作為一個(gè)質(zhì)量分析儀。使用碰撞誘導(dǎo)解離（CIＤ)碎片,分辨率為60０00。該儀器被操作時(shí)，所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有的實(shí)驗(yàn)中使用的噴霧電壓為1。8千伏，毛細(xì)管溫度設(shè)定到１50℃,碰撞能量被設(shè)置為２０%用于MＳ/MＳ實(shí)驗(yàn)。最大掃描時(shí)間被設(shè)置為５0ms，且結(jié)果2至3微掃描的為每個(gè)掃描相加。調(diào)查MS掃描和一個(gè)單獨(dú)的糖基化的肽的ＭS/MS掃描，２0分鐘獲得的質(zhì)量范圍從m／z200到m/z2的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析進(jìn)行采集的原始數(shù)據(jù)的使用Xcalibur2。0．7軟件.對20分鐘的ＭS和MＳ／MS譜進(jìn)行了總結(jié)。納米ＬC—ＭS/MＳ分析消化ACRＡ—４樣品(4升）分別注射使用著名的自動進(jìn)樣器上的C1８柱（Diｏnex公司）上線脫鹽，然后分離在PepMap?18反相（ＲP)的納米柱(3米,７５米１5厘米；Dionｅx公司），并在洗脫６０—miｎ梯度的5%至45%乙腈在0。１%甲酸中，在2７5升/分鐘?！凹{米液相色譜法（nanｏＬC）列線連接到一個(gè)混合型三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀。MS進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析１.4.2軟件（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)的前體離子（PI）掃描觸發(fā)，依賴于信息的采集(ＩDA）.跨質(zhì)量監(jiān)測氧鎓離子的ＨexＮAc的前體離子在m/z２04。08掃描波長為0。2,M/Z=650到1６00，用于檢測糖肽??含有Ｎ－ａcetyｌhexo胺單元的范圍。納流噴霧電壓為2.0千伏,使用在正離子去簇電壓設(shè)置為50eV,用氮?dú)庾鳛榕鲎矚怏w.在IDA分析中，每個(gè)前體離子掃描和增強(qiáng)分辨率掃描后，選定兩個(gè)至三個(gè)最高強(qiáng)度的離子在多個(gè)電荷態(tài)下作為串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS)，根據(jù)不同的電荷狀態(tài)和ｍ/ｚ值的檢測離子滾動碰撞的能量。所有由前體離子掃描獲得的MS/MＳ譜檢測到的糖肽離子，用1.4生物分析軟件解釋并手動檢查（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。細(xì)胞分離和蛋白質(zhì)純化。為了分離細(xì)胞內(nèi)的糖蛋白,在500０轉(zhuǎn)15分鐘4℃下離心沉淀相等數(shù)目的細(xì)胞,在加有1克（體積/體積）的TｒｉtonＸ－100和1毫克/毫升溶菌酶的緩沖液中裂解,在冰里溫育30分鐘.再將細(xì)胞每隔１分鐘超聲3０秒4次。超聲處理的細(xì)胞，在4℃下10,00０轉(zhuǎn)離心2０分鐘并收集上清液,相等數(shù)目的細(xì)胞在500０轉(zhuǎn)4℃下15分鐘離心收集上清液為周質(zhì)和培養(yǎng)準(zhǔn)備。上清液組分經(jīng)0。2微米過濾，然后用密理博的離心超濾管濃縮。將細(xì)胞沉淀洗滌，然后細(xì)胞內(nèi)周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)分餾到其他組分，用冰維持滲透壓在其他地方描述（13，３1)。外膜囊泡(OＭVＳ）中分離出不含細(xì)胞的上清液如前所述（5８）。簡單地說,

在5０00轉(zhuǎn)15分鐘4℃離心后，無細(xì)胞的上清液用0．2微米的真空過濾器過濾，并用28Ｔi轉(zhuǎn)子(貝克曼儀器公司）14１000轉(zhuǎn)2小時(shí)4℃下超速離心，將包含OMVS的顆粒收集在磷酸鹽緩沖液中鹽溶液中(ＰBS,pH7。0)。ＯMV接種在ＬB培養(yǎng)基中并滅菌.在自然條件下根據(jù)說明書用NＴA（Qiageｎ）將6號標(biāo)記蛋白進(jìn)行純化。Fc結(jié)構(gòu)域根據(jù)說明書(賽默飛世爾科技公司）使用Naｂ蛋白A／G的離心柱進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)分析。用SＤS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)(BioRad公司），并如前所述（13）用Westerｎ印跡法進(jìn)行.簡單地說，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVＤF）膜，并把膜進(jìn)行以下操作:抗-MBＰ抗體與芳香胺過氧化物酶(HRP）(ＮewＥnglandＢｉolaｂs公司)共軛,抗-6—Hiｓ抗體和HRP共軛，多克隆抗體針對ＯmｐＸ（14）(由讓—瑪麗·佩奇提供），由空腸彎曲菌的七庚糖生成hＲ6P抗血清（提供由MarkusAＥBI)，,抗人的IgＧ-HRP（Promｅga公司）和SBA—HＲP(Sｉgma公司）共軛。試驗(yàn)中OmpＸ和HR6抗血清，抗兔IgG—HRＰ（Pｒｏmｅｇa公司）作為二次抗體使用。進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISＡ)，使用印涂覆有4微克／毫升牛血清白蛋白（BSA）的地高辛(Siｇma公司)或Fｃ結(jié)構(gòu)域ＮＡＢ蛋白將A/G柱純化。BSA的地高辛－或Fc涂層plaｔｅswere用稀釋的IgG2６．1０的鎳NＴAspin柱(Ｑiaｇen）或FcRI（CＤ６4；Ｒ&D系統(tǒng)）孵育并分別純化樣品?；逦鞲瘳斂焖贆z測鄰苯二胺鹽酸鹽（OPD;Sｉgma公司），反應(yīng)進(jìn)行２0至30分鐘，在4９0nm的酶標(biāo)儀1９0測含量(ＭｏｌecularDevices公司)。對于ＩgＧ的ELISA試劑盒,該信號，所確定的印跡成像反應(yīng)２6．10IｇG抗體的總量。用于測量的綠色熒光蛋白（GＦＰ）熒光活性，使用熒光酶標(biāo)儀（分子移動設(shè)備）進(jìn)行熒光測量。熒光標(biāo)記的細(xì)菌流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡如前所述分析測量（32）.簡單地說，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，1０0微升的細(xì)胞用ＰBＳ洗滌，并用2０微克/毫升的SBＡ－的ＡlexaFlｕor４88(Inｖｉｔrogen公司）中PBS中孵育４5分鐘在黑暗中.，一個(gè)額外的PBS洗滌后,流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)收集在FACＳＣalibｕr系統(tǒng)(BectonDｉcｋinｓon公司）。平均熒光確定從直方圖5０，0００個(gè)事件收集的細(xì)胞發(fā)出的熒光,在掃描模式下使用FACSＣaｌｉbｕｒ流式細(xì)胞儀。對于顯微鏡，15微升細(xì)胞培養(yǎng)用AlexaFｌｕoｒ488標(biāo)記的SBA被放置到一個(gè)的顯微鏡載玻片與蓋玻片。上執(zhí)行的ZeｉssAxiosｋｏp顯微鏡40顯微鏡配備了蔡司1００／1．３0NEOFＬUAR的鏡頭,X－引用光源（ＥXFO,密西沙加，安大略省），和Ｓｅmrock(羅切斯特，NY）中華前景GFＰ排放的過濾器多維數(shù)據(jù)集.數(shù)字圖像現(xiàn)貨Fｌex的數(shù)字相機(jī)(診斷儀器公司）,和控制現(xiàn)貨成像軟件。明視場照明下拍攝的所有圖像在紫外光照射下用于測量的綠色熒光蛋白（GFP）熒光活性，使用熒光酶標(biāo)儀(分子移動設(shè)備)進(jìn)行熒光測量。熒光標(biāo)記的細(xì)菌用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡如前所述分析測量（32）。簡單地說，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，1０0微升的細(xì)胞用ＰBS洗滌,并用2０微克/毫升的SBＡ—的ＡｌexaFluor488（Iｎｖｉtrogen公司）中PBS在黑暗中孵育45分鐘。，多次PBS洗滌后,在FＡCSCalibuｒ系統(tǒng)（BｅctonDickinsｏｎ公司）收集流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)。從直方圖5０,00０個(gè)事件收集的細(xì)胞發(fā)出的熒光中確定平均熒光,在掃描模式下使用FＡCSCaｌibuｒ流式細(xì)胞儀。對于顯微鏡,1５

微升細(xì)胞培養(yǎng)用AlexaFluor488標(biāo)記的SBＡ被放置到顯微鏡載玻片與蓋玻片。ZeｉsｓＡｘioskｏｐ顯微鏡40顯微鏡配備了蔡司１00/1。３0NＥＯFLＵAR的鏡頭,X-引用光源(EＸFO，密西沙加,安大略省)，和Ｓemｒoｃｋ(羅切斯特，NY)中華前景GFＰ排放的過濾器多維數(shù)據(jù)集。數(shù)字圖像使用Flex的數(shù)字相機(jī)(診斷儀器公司)，和控制成像軟件.在紫外光照射下拍攝的所有圖像.圖1重組糖蛋白的糖基化標(biāo)簽大腸桿菌.(一)GＴ是由連續(xù)四個(gè)Ｄ—X1-N-X2-T?ｓequｏｎｓ被有效地在細(xì)菌中的糖基化的.（二）免疫印跡分析(從左至右）與C—末端GT的MBP(MBP—GＴ）,成熟的的MBP缺乏本地信號肽與C-端GT（△spＭＢP－ＧT），空腸彎曲桿菌和本機(jī)糖蛋白ACＲA工程有兩個(gè)額外的糖鏈?zhǔn)荏w位點(diǎn)（ＡCRＡ-4)。蛋白質(zhì)是攜帶pACYＣpgl(+）或pACYCpglmut（－)的細(xì)胞中表達(dá)。(三)Wｅsteｒnｂｌｏt分析（從左至右）ＭBＰ-GT,其原生信號肽序列替換為ＤsbA蛋白的信號肽或TORA，ＭＢＰ的窩藏后，原始信號序列的Ｎ－端GT（sｐMBP-GＴ-MBP）和ＭＢP攜帶Ｎ－和C－末端GT序列(ｓpMBP—GＴ—MBP－GT）。每個(gè)人都表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行pＡCYCpｇｌ。從細(xì)胞裂解液中蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)Ni-NTA親和層析法。每個(gè)車道裝入相同量的蛋白質(zhì)。印跡用抗—His(頂部)或hR6P(底部)抗體.結(jié)果?一種通用受體序列作為N-糖基化的重組蛋白.我們的總體目標(biāo)是系統(tǒng)地評價(jià)大腸桿菌N-連接的糖蛋白分泌到周質(zhì)和其他胞質(zhì)外的糖基化位置。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，我們首先試圖建立一個(gè)肽標(biāo)簽,可在重組基因編碼的感興趣的蛋白質(zhì)，從而使這些蛋白質(zhì)在大腸桿菌中普遍的糖基化。陳和他的同事最近的研究表明序列DQNAT是一個(gè)在體外糖基化最佳的受體者PglＢ(7）。在此基礎(chǔ)上因此,我們的理由是，遺傳修飾的靶蛋白與含有一個(gè)或多個(gè)N－或C－末端肽DQＮAT可能就足夠了攜帶ＰＧL基因的大腸桿菌的N-糖基化。為了測試這個(gè)概念,我們

設(shè)計(jì)了一個(gè)由四個(gè)連續(xù)的甘氨酸殘基(圖１a）的Ｃ—末端GTDQNＡT彼此分離。為了測試該標(biāo)簽的可靠性,我們克隆的大腸桿菌“基因，在質(zhì)粒pＴrc9９A的與C—末端ＧＴ編碼麥芽糖結(jié)合蛋白（MＢP)，,然后由一個(gè)六組氨酸(６-His)的標(biāo)記,以方便純化。將所得的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化同時(shí)攜帶質(zhì)粒pAＣYＣpgl或質(zhì)粒pACＹCpglmｕt的大腸桿菌菌株BL21（ＤＥ3),這分別為(ＰGＬ）或突變的C。的(pgｌmut)的空腸彎曲菌的糖基化基因（57）.重組蛋白細(xì)胞提取物經(jīng)Ni－NTＡ親和層析純化并通過SＤS—PAGE及隨后的免疫印跡分析。

Ｎi—NTA親和純化的餾分細(xì)胞MBＰ-GT表達(dá)的主要是野生型PＧＬ基因下的一個(gè)蛋白質(zhì)量為4５的kＤa和3個(gè)分子質(zhì)量高的蛋白條帶，但不是ｐｇｌmｕt（圖１ｂ)。當(dāng)MBP-GT沒有其在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)時(shí)三高分子質(zhì)量的條帶消失。因此，我們推測,這些較高的分子質(zhì)量條帶以糖基化形式ＭBP-GT大量復(fù)制。為了證實(shí)這一點(diǎn)我們測試hR6Ｐ與純化的抗血清蛋白質(zhì)的反應(yīng)性.這種血清抗空腸彎曲菌全細(xì)胞提取并已被證明優(yōu)先檢測空腸彎曲桿菌N—糖蛋白（馬庫斯AEBI，個(gè)人通信)。只有攜帶ＰGＬ基因細(xì)胞才會MBP—GT,免疫反應(yīng)產(chǎn)生hR６P抗血清（圖1b,底部面板）。無論是MＢP－GT表達(dá)的糖基化缺陷細(xì)胞及細(xì)胞質(zhì)表達(dá)MBＰ-GT檢測抗血清ｈR６Ｐ（圖1b，底部面板).為比較，我們設(shè)計(jì)C?？漳c彎曲菌糖蛋白ACＲA，其中包含4個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)在Ｎ117N1２3N14７N273(ACRA—４)和一個(gè)PELB導(dǎo)出信號，通過段?通路(3４）定位到周質(zhì)。表達(dá)ACRA-4x主管大腸桿菌細(xì)胞的糖基化,生產(chǎn)的多個(gè)高分子

質(zhì)量的蛋白質(zhì)，使用hR6Ｐ抗血清進(jìn)行檢測（圖1b）,說明存在多個(gè)空腸彎曲桿菌的Ｎ—聚糖。

這些聚糖,未發(fā)現(xiàn)AＣRA—4ｘ是糖基化缺陷表達(dá)的細(xì)胞。分析來自由naｎｏＬＣ-MＳ/MS證實(shí)的特性的身份C.ｈeptａsacchaｒideGlcGalＮAｃ5Bac菌（參照圖中的Ｓ1補(bǔ)充材料)的純化MBP-ＧT蛋白質(zhì)的糖基化受體細(xì)胞碎裂的胰蛋白酶肽。提取的色譜峰值分析顯示,被發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)體大致在的比例6４%,34％和２％的1，2,和3—聚糖亞型（數(shù)據(jù)未示出），假設(shè)所有聚糖異構(gòu)體具有相同的離子化效率.應(yīng)該分析指出的是未檢測到一個(gè)四－聚糖亞型（數(shù)據(jù)未示出）與三個(gè)觀察一致不同條帶Ｗestｅrnblot(圖1b和c）。通過SRＰ和Ｔat途徑定位蛋白到周質(zhì)上。上述結(jié)果表明MＢP的糖基化，通過Sｅｃ（３7）途徑定位到周質(zhì).接下來,我們MＢP－ＧT在空腸彎曲菌糖鏈?zhǔn)欠裼刑囟ǜ街稽c(diǎn),同樣可以通過不同的蛋白質(zhì)導(dǎo)出方法，即SRＰ或Tat途徑。值得一提的這兩種出口途徑形成鮮明對比的傳輸機(jī)制。SRP途徑翻譯導(dǎo)出的折疊的蛋白質(zhì)(25，48），而眾所周知Tat的途徑能夠翻譯折疊后的蛋白（1３，4５)。要針對ＭBP－GT的SRP和Tat的途徑,SRP—相關(guān)信號由原生二硫化物變?yōu)樾盘栯呐c異構(gòu)酶I(spDsbA）的（48）和Tat相關(guān)信號變?yōu)槿装種-氧化物還原酶（spTorA)的(47），spＤｓbA—MBP-GＴ或spＴorA_MＢP—GT_的細(xì)胞表達(dá)由抗—Hｉｓ抗體(圖1ｃ）ＰGL基因位點(diǎn)引發(fā)的強(qiáng)烈的信號。在spDsbＡ-MBP—GT情況下的目標(biāo)是SRP途徑，細(xì)胞產(chǎn)生三種蛋白質(zhì)，分別為mｏｎo－,di－，ａnｄｔriglycosyｌａt(yī)ｅd,就像ｈＲ6P的抗血清的MBP—GT反應(yīng)，如圖(圖１ｃ）。上述情況這讓人想起了針對Sec途徑的MＢＰ—GT信號肽。有趣的是,細(xì)胞spToｒＡ-MＢＰ—ＧＴ產(chǎn)生了一個(gè)主要的蛋白質(zhì)頻帶對應(yīng)的ｄｉgｌycosylated形式和兩大部分?較暗的頻段對應(yīng)的單—和triｇｌycosyｌatｅｄ形式（圖1c).因此，細(xì)菌N—連接糖基化的效率出現(xiàn)是不同的蛋白質(zhì)是因?yàn)镾ec／SRＰ途徑,因?yàn)檫@些導(dǎo)出方式不同（即，折疊與展開基板）。值得注意的是，可以觀察到糖的差異性當(dāng)GT序列從MBP的Ｃ末端移動到N末端時(shí)，在天然信號肽（分別比較MＢP－—GT－GＴ和spMBP＿_(dá)MBP圖1ｂ和c線路)的后面。大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)sｐＭＢP—ＧT—MBP的糖基化表達(dá)導(dǎo)致四個(gè)hＲ6Ｐ抗血清蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，然而只觀察到?三個(gè)MBＰ-GT蛋白質(zhì)與此血清反應(yīng)（圖１ｃ)。這表明，最多四個(gè)空腸彎曲菌N-聚糖共價(jià)連接到sｐＭＢＰ—ＧT－ＭＢP。當(dāng)ＧＴ同時(shí)在MBP的Ｎ末端和C末端，7個(gè)蛋白hR6P抗血清進(jìn)行反應(yīng)性檢測(圖1ｂ和c），從而產(chǎn)生迄今在細(xì)菌中最廣泛的糖基化蛋白質(zhì)表達(dá).觀察ＭBP經(jīng)過SRP和Ｔat途徑N-連接糖基化水平存在差異，接下來我們解決這是否是?GT受體肽或者其他糖蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的一個(gè)較普遍的現(xiàn)象。為了測試這一點(diǎn)，如上所述我們修改了AＣRA—4－構(gòu)造,信號肽在Ｔat（ｓpTorA）,Ｓeｃ（ｓpMＢP），ＳＲP（spDsｂA）的途徑,并確定了每一個(gè)通過SＤS—PAGE和免疫印跡的抗—His或ｈR6P抗血清的糖基化狀態(tài).不同于MBＰ-ＧＴ,受體都聚集在蛋白質(zhì)的C末端，ACRA—４＿糖基化位點(diǎn)分布在整個(gè)蛋白質(zhì)。糖基化受體細(xì)胞中的周質(zhì)提取物包含抗His-蛋白(圖2ａ）。然而,只有spＭＢP－ACRＡ－4引起更高分子量的抗-Hiｓ抗體。與此相反，sｐTorAＡＣRＡ-4—和sｐDsbAAＣRA-4－構(gòu)成各產(chǎn)生了只有一個(gè)在３７kDa的帶。spToｒＡＡＣＲA-4x和spDsbAＡＣRA-４x更高分子量的缺乏的比例表明，相對于spMBP-AcｒAＶOＬ,aｇlyｃosylated的ＡCRA糖基化是相當(dāng)?shù)偷牡膱D2糖蛋白的內(nèi)膜易位.ＡＣRA—4的Westernbｌot分析,有針對性地表達(dá)（sｐＴorA），ＳＲP（spDｓbA）,Seｃ(sｐMBP）蛋白出口途徑。用Ni－NTＡ親和層析法從細(xì)胞周質(zhì)餾分純化蛋白質(zhì)。盡管如此，出口經(jīng)由每個(gè)這些途徑引起糖化ACRＡ,確認(rèn)通過Wesｔerｎ印跡與hＲ６Ｐ抗體(圖2b)。二段和SＲP途徑觸發(fā)四種蛋白質(zhì)的檢測,表示的混合物，單—，二-，的三和ｔeｔｒａglycoｓylatｅｄ形式ＡＣRA－４事實(shí)上,naｎoＬC-MS/MS分析證實(shí)了Ｎ-連接糖基化在所有四個(gè)地點(diǎn)（顯示為sｐMBPACRA-4×圖S２的補(bǔ)充材料）。一個(gè)稍微不同的結(jié)果時(shí),得到AＣRA-4×有針對性地Ｔａt(yī)的途徑。ｓpＴorAAＣRA－4的表達(dá)和功能ｐgｌｌocuｓ產(chǎn)生一個(gè)單一的較慢的遷移,與ｈR6P（圖2ｂ）的抗血清有交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)。該頻帶的分子質(zhì)量只是在５０kDａ的,這可能對應(yīng)ｔetrａglyｃｏsylatedACＲA－４×(44．2kDa的）,保留了其N－末端,spTｏrA信號肽（4。2kDa的）。事實(shí)上，已經(jīng)觀察到，過度底物和細(xì)胞應(yīng)激去除信號肽在大腸桿菌中的表達(dá)(19，５４）的效率產(chǎn)生不利影響?；诰徛桑睿醤oＬC—MＳ／ＭS在所有四個(gè)站點(diǎn)(數(shù)據(jù)未示出），它揭示的N—連接的糖基化,這種蛋白質(zhì)和其分析的電泳遷移率,我們得出這樣的結(jié)論:tetｒaglycosylatedＡCＲA-4×是由達(dá)途徑的主要糖化種類.拍攝到ｇetheｒ,蛋白質(zhì)定位到達(dá),秒，和SRP通路所有成為N糖基化的，Ｔat比秒/SＲP基板中的糖基化模式的變化,可能反映了不同的底物的構(gòu)象（折疊與展開)，被提交至OSＴ.Ｎ—連接的糖基化在周質(zhì)中的非細(xì)菌性蛋白質(zhì)。接下來，我們確定是否GＴ序列可能允許非細(xì)菌性底物的N-糖基化大腸桿菌本地化的蛋白質(zhì)周質(zhì)中的攜帶的ＰGL基因簇。作為第一目標(biāo)，我們選擇了的TOＰ7蛋白質(zhì)，ADE從頭設(shè)計(jì)α/β？蛋白折疊成的結(jié)構(gòu)性質(zhì)（36）中沒有觀察到。我們修改ＴO(shè)P７與N－末端DｓbA的出口信號和C—末端GＴ。在糖基化能力的細(xì)胞中的表達(dá),spDsｂA－TＯP7-GＴ與抗-Hiｓ抗體反應(yīng),顯然是糖基化的基礎(chǔ)上其朝hR6P（圖3ａ)的反應(yīng)活性.接下來,我們檢查獨(dú)立非執(zhí)行董事GFPｍｕt２,折疊，熒光激活細(xì)胞排序的（FACS）優(yōu)化變異的GFP（11）。GFP的熒光,是只有當(dāng)它被允許在細(xì)胞質(zhì)中的革蘭氏陰性菌（１５）折疊。由于這一特殊的屬性，導(dǎo)出達(dá)的途徑是通過只有這樣，才能定位到周質(zhì)的熒光綠色熒光蛋白（１8，46，55）.因此,一個(gè)spTorA－GFP—GT創(chuàng)建和嵌合體中存在的官能PGL軌跡表示.提取菌株含有這種結(jié)構(gòu)引起了強(qiáng)烈的信號，與ｈR6P抗血清（圖3a）。最后,我們研究一個(gè)完整長度的哺乳動物來源的抗體,26-10的鼠抗地高辛抗體（IgG抗體26.1０）(41）。Simｍｏns和他的同事們表明先前agｌycｏsylatｅd的的IgＧ的表達(dá)是可能的在大腸桿菌中通過單獨(dú)的表達(dá)和IgG重鏈和輕鏈的周質(zhì)(50)的定位。以類似的方式，我們針對ＤsbＡ蛋白和一個(gè)的PELＢ導(dǎo)出信號(41）,分別通過一個(gè)到周質(zhì)的輕和重鏈的IgG２６.10.此外,我們修訂了重鏈通過C－末端ＧT受體序列的糖基化。ＩgG表達(dá)和純化之后，蛋白質(zhì)反應(yīng)性朝向hR6P僅在檢測到功能PＧＬ軌跡（圖3ａ）的存在下,表明細(xì)菌聚糖的共價(jià)附著。要確定是否糖基化影響這些重組糖蛋白功能,我們研究了我們設(shè)計(jì)的綠色熒光蛋白和IｇG26．1０結(jié)構(gòu)后表達(dá)的糖基化能力的細(xì)胞。在情況下spTorA-GＦP—ＧＴ,GＦＰ的熒光活性不受影響由除空腸彎曲桿菌的N—聚糖，雖然另外的GＴ序列確實(shí)引起了近３０%減少在spTorA—GFＰ的熒光相對未經(jīng)GT(圖3b)表示的版本。因此，我們得出結(jié)論,綠色熒光蛋白標(biāo)簽本身的的熒光適度下降，這是獨(dú)立的糖基化過程。我們還研究了結(jié)合活性的大腸桿菌表達(dá)對同源抗原地高辛抗體26。10。IgＧ的26。1０產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在細(xì)胞活躍或不活躍的PGL基因簇的活動實(shí)際上是相同的，作為衡量ELISA(圖3c），它是類似的GFP的情況下，表示的糖基化的過程沒有影響的抗原結(jié)合活性的IgG２6。10.26。10與IｇＧ的結(jié)果的鼓舞，接下來我們決定是否在N297中的IgG1的Fｃ受體域保守的受體位點(diǎn)被糖基化在細(xì)菌系統(tǒng)。為了解決這個(gè)問題，我們克隆IgＧ1的Fc結(jié)構(gòu)域與三重突變(Ｑ2９５DY２9６QS29８A)編碼的的首選DQNＡＴseｑuon的N２97為ＰｇｌB介導(dǎo)的糖基化(的FｃＤQNＡT突變）的突變體。攜帶的PGL的基因在大腸桿菌細(xì)胞的表達(dá),的Ｆｃ的DＱＮＡＴ的突變體，但不是野生型FC有效地?糖基化(圖3a）.值得注意的是,盡管有這種糖基化作用在N297，細(xì)菌糖基化的FcＤQＮAT沒有觀察到結(jié)合的FｃＲI受體,通過ELISA測定，而一個(gè)aｇｌｙｃｏsylaｔeｄ的Fｃ的變種(Fc的E38２VM428I)被設(shè)計(jì)，以結(jié)合的FｃRＩ(28)給了強(qiáng)烈的的ELISA信號（參見圖S3中的補(bǔ)充材料)。這表明，細(xì)菌的Ｎ—聚糖是不足以用于創(chuàng)建向“開”構(gòu)象所需的Fc受體結(jié)合（35),或氨基酸周圍Ａsn２97（即，Q29５，Ｙ296和S2９8）需要與N一起糖基化結(jié)合的FcＲI恢復(fù)。圖3不同的糖基化的重組蛋白糖基化大腸桿菌。（一)Weｓterｎ印跡分析（從左至右）MBＰ－ＧT帶或不帶其天然信號肽，TＯＰ７-GT與DｓbA的信號肽，GＦP-GT與ＴＯRＡ信號肽，和鼠抗地高辛抗體26．１０與pelB信號肽上的輕鏈上的，也被附加與重鏈ＧT和DsbA蛋白信號肽。攜帶pACYCpgl（？）或pACYCpglmut(?）細(xì)胞中的蛋白表達(dá).印跡與抗-His(左）或ｈR6P（右)抗體探測。與抗人抗體（頂部)和SＢA（底部）進(jìn)行Weｓteｒｎ印跡分析的野生型的Fc（重量的Fｃ)和FcDQNAT。（二）熒光表達(dá)spTｏrA—GFＰ或ｓpＴorＡ的GFＰ-GTPＧＬPGL物細(xì)胞中的細(xì)胞。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的平均值結(jié)果實(shí)驗(yàn)，及標(biāo)準(zhǔn)誤差是小于5％。(三)ELISＡ信號板涂有共軛BＳＡ異羥基毛地黃毒苷（DＩG)和2６．10ＰGLＰGLMUＴ細(xì)胞IgＧ的純化用。BSA異羥基毛地黃毒苷（DIG)控制的井，從PGＬ細(xì)胞的培養(yǎng)與２6。１0ＩｇG的純化。本土化的外膜糖蛋白的N-聯(lián).迄今為止,只有可溶性周質(zhì)蛋白被糖基化的在大腸桿菌細(xì)胞攜帶ｔhepgｌlｏcus。因此，我們進(jìn)一步探討是否外膜蛋白可能是N糖基化。以類似的方式ＭＢP的上述策略,我們設(shè)計(jì)的ＧT受體序列到的外膜蛋白OmｐX外第二環(huán)（44）從大腸桿菌中。細(xì)胞表達(dá)OmpX—GT中的存在下產(chǎn)生的糖基化的OmｐXｐglｌocus，而OmｐX－GT表示在ＰGＬ物軌跡細(xì)胞攜帶表明沒有檢測到的糖基化(圖4a）。要確認(rèn)的糖化ＯｍpＸ-GT定位于外膜,我們試圖完整的大腸桿菌細(xì)胞標(biāo)記，熒光標(biāo)記的版本ＳBA(SBA的AlexaFlｕor488）。由于外源凝集素SBＡ終端半乳糖胺殘留量的Ｃ。菌ｈeptasaｃcharide的如選擇性地結(jié)合，我們推測,，如果OmｐX—GT定位于外膜，Ｎ-GLY—罐外循環(huán)2將訪問SBA綁定INＧ。另外，由于SＢA是120000達(dá)四聚體,它交叉外膜太大,從而被限制的結(jié)合只有那些在細(xì)胞表面上所顯示的N－聚糖。出乎我們的意料，大腸桿菌細(xì)胞的PGＬ位點(diǎn)的受體蛋白的情況下給予了強(qiáng)烈的熒光信號SBA的AleｘaFluｏr488標(biāo)記，而質(zhì)粒的細(xì)胞無熒光(見圖S4ａ和ｂ中的補(bǔ)充材料）。該信號是不依賴于Ｐg(shù)lB，作為標(biāo)識PＧLMUＴ細(xì)胞中，同樣高的細(xì)胞熒光（S4C補(bǔ)充材料）.我們懷疑,這種熒光是由于空腸彎曲菌N-糖基轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)A和隨后的本土化的這糖脂共軛的外膜。我們的假設(shè)的基礎(chǔ)是觀察unｄecaprenyｌ焦磷酸－磷酸鹽—連接的寡糖的基板的連接酶，大腸桿菌Waal的轉(zhuǎn)移從的uｎdｅcaｐrｅnol脂質(zhì)載體的脂質(zhì)Ａ核心分子(43）的寡糖.為了測試這個(gè)概念，我們創(chuàng)建了一個(gè)大腸桿菌菌株的基因組副本失活Waal的或waａC的的等位基因更換突變的。Ｏ—抗原的連接酶，催化轉(zhuǎn)移的O－抗原的脂多糖（LPＳ）的核心,在Waal基因的代碼,而LＰSheptosyl轉(zhuǎn)移的Ｉ，它傳輸?shù)牡谝桓菤埢系膬?nèi)部核心的ｗaaC基因的代碼ＬPＳ（４3).事實(shí)上,Wａal的和waａC的缺陷的