腦血管疾病發(fā)生和防治的基礎(chǔ)研究

工程名稱：腦血管疾病發(fā)生和防治的根底研究首席科學(xué)家：蘇定馮中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)起止年限：2021.1至2021.8依托部門：總后勤部衛(wèi)生部上海市科委

一、研究內(nèi)容以腦卒中為代表的腦血管疾病發(fā)生率高、危害性大。腦卒中的發(fā)生具有不可預(yù)測性，發(fā)生以后有效治療的時間窗很小(3-6小時)，神經(jīng)細胞一旦死亡病人的功能恢復(fù)非常困難。盡管急性期腦卒中的死亡率顯著下降，但腦卒中的發(fā)生率是有增無減、越來越高。因此，預(yù)防腦卒中的發(fā)生是關(guān)系國計民生的重大科學(xué)問題。本工程要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是：(1)以腦卒中的發(fā)生機制為重點研究內(nèi)容，確立干預(yù)腦卒中發(fā)生的新靶標。首先要深刻認識腦卒中發(fā)生的病理生理學(xué)機制和影響其發(fā)生的相關(guān)因素，找出其中可以作為藥物干預(yù)的新的靶點，用經(jīng)典的藥物、基因治療、轉(zhuǎn)基因、基因敲除、RNA干擾等手段，對這些新的靶點進行驗證性治療，最終確定3-5個可用于腦卒中預(yù)防的新靶標；(2)以嚴格的腦卒中分型診斷和顱內(nèi)動脈影像學(xué)診斷為根底，研究易感基因。通過嚴格的腦卒中分型診斷，建立腦卒中病人的分型數(shù)據(jù)庫；通過嚴格的腦血管影像學(xué)檢查，建立腦血管狹窄病人數(shù)據(jù)庫。對他們的DNA進行SNP分析和其他研究，發(fā)現(xiàn)中國人各型腦卒中和高血壓伴顱內(nèi)動脈狹窄的易感基因，找出高效率的預(yù)測腦卒中發(fā)生的新指標。根據(jù)這些指標，探討對高危人群進行干預(yù)的可能性；(3)以神經(jīng)血管單元為對象，研究如何改善腦卒中的治療。在腦卒中神經(jīng)損傷與保護的研究方面，我們不應(yīng)把恢復(fù)腦血流和保護神經(jīng)元作為兩個獨立的治療目標，而是要把神經(jīng)血管單元作為一個整體進行研究。發(fā)現(xiàn)新的調(diào)節(jié)因素，作為干預(yù)靶點，改善腦卒中的治療；(4)探索新技術(shù)、新方法和新的活性化合物在腦卒中研究和防治中的應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的開展，一大批新的技術(shù)和方法用于或?qū)⒁糜谂R床。但在腦卒中的防治中尚不成熟。此外，腦卒中發(fā)生開展的深入的分子機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。在本工程研究中，我們將首先完善兩個技術(shù)平臺：轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺和化學(xué)生物學(xué)平臺(小分子探針技術(shù)平臺)。利用這兩個技術(shù)平臺說明腦卒中發(fā)生開展的深入的分子機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，驗證我們發(fā)現(xiàn)的腦卒中預(yù)防和治療的新靶點。并希望給以后的臨床應(yīng)用提供理論根底。(一)腦卒中發(fā)生新的決定或影響因素研究鑒于的有關(guān)因素缺乏于解釋腦卒中的發(fā)生，因此研究新的決定或影響因素是當(dāng)今重要的研究前沿。以血管為基準，我們把這些影響因素分為血管內(nèi)、血管壁和血管外三個方面來表達。從血管外(或全身性)因素看，關(guān)鍵的科學(xué)問題有：(1)動脈壓力感受性反射(ABR)功能。我們以前的工作提示ABR功能低下導(dǎo)致腦卒中易發(fā)。那么，ABR功能低下是如何導(dǎo)致腦卒中易發(fā)的？尼古丁alpha7受體是否起重要作用？沒有高血壓存在的情況下，ABR功能低下是否也能導(dǎo)致腦卒中易發(fā)？(2)熱量限制。我們在以往的研究中發(fā)現(xiàn)熱量限制可以大幅度地延緩腦卒中的發(fā)生。那么，熱量限制延緩腦卒中發(fā)生的主要機制是什么？Sirtuin是否起決定性作用？有無可能找到熱量限制起保護作用的靶分子？由于熱量限制在實踐中不容易推廣，有無可能用相應(yīng)的靶分子作為藥物新靶點，用藥物替代限食？(3)炎癥反響。全身性的炎癥反響與腦卒中的發(fā)生有沒有確切的關(guān)系？抗炎治療能否作為腦卒中預(yù)防的新策略？在腦卒中的發(fā)生中最重要的炎癥因子是哪一個？(4)脂肪細胞因子。具有調(diào)節(jié)代謝、胰島素敏感性、血管功能、炎癥免疫等多種功能活性的脂肪細胞因子能否作為腦卒中防治新靶標？能否尋找到有效調(diào)節(jié)脂肪細胞因子表達/活性的天然活性化合物？其腦卒中的防治療效和機制如何？從血管因素看，血管重構(gòu)是腦血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵。以往對離子通道在腦血管重構(gòu)中所起作用研究較少。少量的研究也僅僅涉及陽離子通道，對于氯離子通道在其中的作用主要由本工程組成員開展研究，剛剛起步。關(guān)鍵的科學(xué)問題有：平滑肌Cl-通道〔容積調(diào)節(jié)性/ClC-3及Ca2+激活Cl-通道〕與Ca2+通道〔ROC和SOC〕是怎樣參與腦血管重構(gòu)的？這些通道在腦卒中發(fā)生過程中起什么樣的作用？其作用相關(guān)的分子機制是什么？如何為防治腦血管重構(gòu)、進而預(yù)防腦卒中從離子通道角度提出新思路及新靶點？從血管內(nèi)因素看，關(guān)鍵的科學(xué)問題有：巨噬細胞吞噬脂質(zhì)成為泡沫細胞，與T淋巴細胞相互作用，分泌大量炎性因子，產(chǎn)生活動性炎癥是不穩(wěn)定斑塊的重要特征。Tim分子對巨噬細胞及T淋巴細胞均有重要調(diào)控作用，Tim在巨噬細胞泡沫化、與T淋巴細胞相互作用并介導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷中發(fā)揮什么作用？哪些分子在此過程中起到關(guān)鍵作用？能否針對這些分子進行干預(yù)以減輕或消除斑塊內(nèi)炎癥？多種炎癥因子可通過增強斑塊纖維帽膠原的分解代謝途徑而誘導(dǎo)斑塊破裂，但這些因子在膠原代謝中的分子調(diào)節(jié)機制尚不清楚。能否通過研究炎癥因子對各個膠原酶轉(zhuǎn)錄的影響以明確炎癥在斑塊易損中的作用機制和發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)靶點？為解決這些科學(xué)問題，擬進行以下三方面的研究：1.影響腦卒中發(fā)生的全身性因素。(1)建立動物模型：對于腦卒中的動物實驗大局部采用大腦中動脈阻塞，觀察腦損傷情況。如果要對預(yù)防腦卒中的作用進行評價，必須使用自發(fā)性腦卒中動物模型。大鼠有遺傳性的SHR-SP，但無法用于小鼠，這是個世界性難題。因此，建立小鼠自發(fā)性腦卒中動物模型十分必要，以便能使用基因敲除小鼠來研究自發(fā)性腦卒中的發(fā)生；(2)針對ABR功能。用alpah7基因敲除小鼠研究ABR功能低下導(dǎo)致腦卒中易發(fā)的alpha7機制；用我們自己培育的全世界唯一的自發(fā)性ABR功能缺陷大鼠進一步研究ABR功能與腦卒中的關(guān)系；尋找改善ABR功能的藥物，用于腦卒中的預(yù)防；(3)針對熱量限制。用Sirt1基因敲除小鼠和慢病毒RNA干擾，研究限食延緩腦卒中的Sirtuin機制；從天然藥材中篩選Sirt1沖動劑并用于腦卒中的預(yù)防；熱量限制發(fā)揮腦卒中保護作用的其他機制研究，包括雌激素受體機制、ABR功能改善機制等；(4)針對炎癥因子。用SHR-SP與普通的SHR比擬，觀察各組織和血清中炎癥因子(或與炎癥反響有關(guān)的因子)的差異表達。對差異表達明顯的因子的相應(yīng)基因進行測序，觀察DNA有無突變位點，進一步研究該突變位點對蛋白表達有無影響(意義)。用基因敲除小鼠，制成2腎2夾自發(fā)性腦卒中模型，觀察白介6、白介10、E－選擇素等在腦卒中發(fā)生中的作用。用過表達的方法觀察以上因子對SHR-SP腦卒中發(fā)生的影響；(5)針對脂肪細胞因子。采用多種干預(yù)手段，如：visfatin重組蛋白、特異性酶抑制劑FK866、酶產(chǎn)物NMN、抗體、基因overexpression、基因knockdown等，確認visfatin能否作為腦卒中防治新靶標；尋找能上調(diào)visfatin表達的天然活性化合物，研究其腦卒中防治療效和機制；采用基因芯片差異篩選等策略，發(fā)現(xiàn)新的脂肪細胞因子，研究其對血管、腦細胞的作用，確認其能否成為腦卒中防治新靶標。(6)針對其他因素。通過蛋白質(zhì)組學(xué)、基因芯片、代謝組學(xué)和miRNA芯片等手段，用SHR-SP和普通的SHR進行比擬(以利于去除高血壓引起的差異)，找出差異，進行深入的研究。比方我們發(fā)現(xiàn)SHR-SP大腦中的醛脫氫酶顯著低于SHR，該酶的產(chǎn)物之一dopac降低。我們將研究：首先醛脫氫酶是怎樣降低的，對相應(yīng)的基因DNA測序，發(fā)現(xiàn)有無突變位點，如有特別，確定該突變是否足以引起表達差異?；蛘哒{(diào)節(jié)醛脫氫酶的基因發(fā)生了改變，等等。其次，研究醛脫氫酶降低的后果(底物dopal是一種醛，有細胞毒性)，是否與腦卒中的發(fā)生有關(guān)。2.影響腦卒中發(fā)生的血管壁因素。用SHRSP及2腎2夾腎血管性高血壓大鼠研究氯離子通道和鈣離子通道在腦血管重構(gòu)中的作用：(1)Ca2+激活Cl-通道。探討在高血壓腦血管重構(gòu)過程中及腦卒中發(fā)生的腦血管平滑肌細胞Ca2+激活Cl-通道活性與調(diào)節(jié)的變化，以及與Ca2+調(diào)控之間的關(guān)系；(2)容積調(diào)節(jié)/ClC-3Cl-通道。研究高血壓腦血管重構(gòu)/腦卒中腦血管平滑肌細胞該通道的功能及調(diào)節(jié)通路變異；建立靶向敲除血管平滑肌ClC-3動物模型，在此根底上建立相應(yīng)野生型動物高血壓模型，在基因水平比擬ClC-3對腦血管重構(gòu)的影響；研究ClC-3對腦血管平滑肌細胞增殖/凋亡調(diào)節(jié)機理；確定ClC-3功能型酪氨酸磷酸化位點；研究ClC-3-ROS在腦卒中發(fā)生所扮演的角色；(3)Ca2+通道。研究在腦血管重構(gòu)及腦卒中發(fā)生過程腦血管平滑肌細胞ROC/SOC功能變化；研究ROC/SOC對腦血管平滑肌細胞增殖/凋亡及ROS生成作用與機理；觀察特異性阻斷ROC/SOC的人參皂甙單體Rd干預(yù)后對腦血管重構(gòu)腦卒中的作用及相關(guān)作用機理。3.影響腦卒中發(fā)生的血管內(nèi)因素。(1)不穩(wěn)定斑塊活動性炎癥機制的研究。巨噬細胞泡沫化及其與T細胞的相互作用在不穩(wěn)定斑塊活動性炎癥形成中具有重要作用。擬研究Tim分子在不穩(wěn)定斑塊形成中各類免疫細胞上的表達及其表達調(diào)控模式；Tim在AS特異性抗原ox-LDL活化巨噬細胞中的作用及其分子機制；Tim對巨噬細胞-T淋巴細胞相互作用的影響；Tim通路在斑塊破裂過程中主要炎癥細胞功能發(fā)揮中的作用，尋找關(guān)鍵分子，應(yīng)用siRNA等手段干擾關(guān)鍵分子或其胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路以觀察對不穩(wěn)定斑塊破裂的影響；(2)炎癥介導(dǎo)血管膠原代謝的分子機制研究。我們首次說明了TNF導(dǎo)致斑塊纖維帽膠原降解和斑塊易損的ASK1–JNK–NonO的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。擬繼續(xù)做如下研究：觀察血管炎癥中主要的炎性因子對腦血管壁中富含的I型、III型和VI型膠原代謝的影響；應(yīng)用siRNA及PGL-3熒光報告載體等技術(shù),發(fā)現(xiàn)啟動子反響序列及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，并應(yīng)用通路抑制劑和過表達載體等觀察炎癥因子干預(yù)膠原代謝的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；研究TNF對P4H1干預(yù)調(diào)節(jié)的機制，觀察NonO和DJ-1蛋白的變化。觀察ROS通路在TNF導(dǎo)致的DJ-1過氧化形成OX-DJ-1的過程中所起的作用；(3)其他研究。包括高血壓導(dǎo)致血管壁細胞凋亡機制的研究，非瓣膜病心房顫抖時血栓形成機制的研究，腦卒中早期生物標志物的研究和血管內(nèi)皮細胞eNOS表達分子機制的研究等。(二)腦卒中的易感基因研究腦卒中有許多亞型，各種亞型的發(fā)生機制不一樣，其相應(yīng)的易感基因也可能不一樣。以往對腦卒中易感基因的研究成效不大的原因可能與此有關(guān)。能否通過建立中國人的腦卒中分型資料庫，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)病機制分型的腦卒中患者的易感基因，提高腦卒中預(yù)測、預(yù)防的有效性，是一個重要的問題。此外，顱內(nèi)動脈狹窄是國人缺血性腦卒中的理想中間表型。能否通過研究與顱內(nèi)動脈狹窄相關(guān)易感基因，識別國人缺血性腦卒中易感基因，進而找出可用作預(yù)測、預(yù)防腦卒中的基因變異？為解決這些問題，本工程擬進行以下研究工作：1.研究各亞型腦卒中的易感基因。通過進行包括腦卒中臨床、實驗室檢查、輔助檢查、治療及預(yù)后等信息的大樣本登記研究，建立以發(fā)病機制為根底的腦卒中分型數(shù)據(jù)庫，研究不同發(fā)病機制分型腦卒中患者的生化標記物和易感基因，對不同的發(fā)病機制分型與患者的臨床表現(xiàn)與預(yù)后等進行相關(guān)性研究。2.研究顱內(nèi)動脈狹窄病人的易感基因。通過對高血壓患者中無病癥性顱內(nèi)動脈狹窄的篩查及其危險因素分析，為全基因組關(guān)聯(lián)研究提供樣本，并說明高血壓患者發(fā)生顱內(nèi)動脈狹窄的危險因素；開展顱內(nèi)動脈狹窄的全基因組關(guān)聯(lián)研究，識別國人高血壓患者中與顱內(nèi)動脈狹窄相關(guān)的SNP位點；通過為期3年的隨訪研究，進一步驗證上述研究發(fā)現(xiàn)的基因位點及心血管危險因素在顱內(nèi)動脈狹窄發(fā)生、開展中的作用。3.腦卒中的家系研究。大局部腦卒中的遺傳屬于多基因遺傳，但是也存在一些以腦卒中為主要表現(xiàn)的單基因遺傳病。對腦卒中的特殊家系研究，有可能發(fā)現(xiàn)新的單基因遺傳性疾病。如果是多基因遺傳，家系研究也有助于發(fā)現(xiàn)易感基因。我們最近收集到2個大的腦卒中家系。(三)針對腦卒中神經(jīng)損傷和神經(jīng)保護的研究針對缺血性腦卒中神經(jīng)損傷與神經(jīng)保護的研究，長期以來主要聚焦于神經(jīng)元而忽略了占腦體積90％以上的神經(jīng)膠質(zhì)細胞(包括星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等〕。近年來的研究說明保護膠質(zhì)細胞的正常生理功能已經(jīng)成為腦卒中神經(jīng)保護的重要策略。進而，應(yīng)該重視神經(jīng)血管單元(neurovascularunit)的集成研究。神經(jīng)血管單元包括：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞及胞外基質(zhì)等。但是對該單元中各組分的相互調(diào)節(jié)作用尚缺乏研究，在腦卒中發(fā)生時的相互依賴關(guān)系尚不清楚。在腦卒中發(fā)生時起保護作用的內(nèi)源性物質(zhì)有哪些？能否作為藥物作用的新靶點？腦卒中損傷進程中神經(jīng)再生障礙的細胞與分子機制是什么？為答復(fù)這些問題，擬進行如下研究：1.系統(tǒng)研究神經(jīng)-血管單元在腦卒中神經(jīng)損傷中的作用及其相互調(diào)節(jié)，說明腦卒中神經(jīng)損傷的關(guān)鍵病理機制，為臨床治療學(xué)的突破提供有益的思路與策略；2.發(fā)現(xiàn)與腦卒中神經(jīng)損傷高度相關(guān)的基因、受體、離子通道、酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子等，為研發(fā)理想的神經(jīng)保護劑提供新的靶點；3.應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)知識與技術(shù)，探索增強的內(nèi)源性神經(jīng)保護的途徑，發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)源性神經(jīng)保護通路及其調(diào)節(jié)規(guī)律；4.研究、說明腦卒中損傷進程中神經(jīng)再生障礙的細胞與分子機制，探索促神經(jīng)再生和干細胞移植在腦卒中神經(jīng)損傷治療中的應(yīng)用及其學(xué)術(shù)根底；5.根據(jù)學(xué)術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的新靶點，設(shè)計、合成及從天然產(chǎn)物中獲得靶向性先導(dǎo)化合物，為開展自主創(chuàng)新的神經(jīng)保護劑積累根底。(四)新技術(shù)、新方法和新化合物在腦卒中研究和防治中的應(yīng)用隨著分子生物學(xué)的開展，一些新技術(shù)和新方法應(yīng)用于根底研究。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在研究疾病發(fā)生的分子機制和發(fā)現(xiàn)新治療靶點的過程中具有不可替代的作用，通過融入RNA干擾等其它新技術(shù)，人為調(diào)高或者調(diào)低特定蛋白質(zhì)的表達，可以驗證和確定我們前期發(fā)現(xiàn)的和本工程新發(fā)現(xiàn)的腦卒中發(fā)病原理，獲得具有潛在應(yīng)用價值的新治療靶點。此外，把小分子化合物作為小分子探針，探索與某些疾病有關(guān)的靶分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路越來越受到人們的重視。我們現(xiàn)有兩個技術(shù)平臺：轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺和化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺。如何利用這兩個技術(shù)平臺為腦卒中發(fā)生、防治的根底研究效勞，是本工程要解決的關(guān)鍵問題。1.在其它課題組發(fā)現(xiàn)對腦卒中邊緣區(qū)細胞轉(zhuǎn)歸有益和有害因子，提出腦卒中邊緣區(qū)細胞轉(zhuǎn)歸機制新理論的根底上，協(xié)助其它課題組制備攜帶這些基因的載體或攜帶能產(chǎn)生這些基因siRNA的載體，通過邊緣區(qū)轉(zhuǎn)基因，觀察其對腦卒中轉(zhuǎn)歸的影響，以明確我們新發(fā)現(xiàn)的邊緣區(qū)細胞轉(zhuǎn)歸的分子機制，找出新的治療靶點。2.經(jīng)尾靜脈給SHR-SP注射帶類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)的I型腺相關(guān)病毒載體〔AAV1-StAR〕，人為提高肝臟內(nèi)去除血脂的次要途徑，觀察腦動脈粥樣硬化的形成、腦動脈張力、腦卒中發(fā)生率和嚴重程度。為我們提出的通過肝臟轉(zhuǎn)基因，提高原本次要的將血脂去除出體外或者動脈壁的途徑，到達穩(wěn)定甚至消除動脈粥樣硬化斑塊、降低腦卒中發(fā)生率的目的的新策略提供實驗依據(jù)。3.給SHR-SP的腦動脈轉(zhuǎn)染AAV1-StAR，提高血管內(nèi)皮細胞去除和逆向轉(zhuǎn)運膽固醇的能力，觀察其對腦卒中發(fā)生率和嚴重程度的影響，探討通過調(diào)控腦動脈內(nèi)皮細胞脂質(zhì)代謝預(yù)防再卒中的假設(shè)。4.給SHR-SP的腦動脈轉(zhuǎn)染AAV1-IL-10〔白介素-10〕，提高血管內(nèi)皮細胞生存力，抑制血管內(nèi)膜炎癥，觀察其對腦卒中發(fā)生率和嚴重程度的影響，驗證通過持續(xù)抑制腦動脈內(nèi)膜炎癥預(yù)防再卒中的假設(shè)。5.用實時PCR列陣、多因子酶標檢測法從病灶組織中篩選出表達增加最明顯的5種對炎癥有調(diào)節(jié)作用的細胞因子或化學(xué)因子，制備相應(yīng)的AAV1基因載體，轉(zhuǎn)染MSC并用于腦卒中實驗性治療，比擬它們對腦缺血后再灌注的損傷與炎癥、邊緣區(qū)細胞和轉(zhuǎn)基因細胞本身的轉(zhuǎn)歸、血管重構(gòu)、血管新生以及大鼠神經(jīng)功能與行為障礙的影響，明確腦卒中病癥微環(huán)境中最重要的影響邊緣區(qū)細胞轉(zhuǎn)歸的因子，并獲得1-2個新的治療靶點基因。6.我們建立化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺包含了從500種常用中藥里別離出40000個中藥小分子組分(平均每個組分含11個單體化合物)。我們已經(jīng)找到了一個水通道蛋白4(AQP4)的阻斷劑和一個氯離子通道阻斷劑。此外，目前正在篩選的新化合物主要針對本工程組其他人提出的新的靶分子，如Sirt1的沖動劑、7受體沖動劑、白介素6的拮抗劑等。提供各個課題組進行深入的研究。

二、預(yù)期目標總體目標：本工程以腦卒中發(fā)生的決定因素或影響因素為研究重點，以SHR-SP大鼠和2腎2夾自發(fā)性腦卒中小鼠為根本動物模型，以整體動物腦卒中發(fā)生實驗、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、基因敲除、RNA干擾等為根本手段，通過深入的病理生理學(xué)研究，說明腦卒中發(fā)生的新的決定或影響因素。并用基因轉(zhuǎn)移和新的來源于植物的活性化合物針對新靶點進行試驗性治療，以驗證可能的預(yù)防腦卒中的新靶點。同時，以現(xiàn)有的腦卒中分型數(shù)據(jù)庫和顱內(nèi)動脈狹窄病人的數(shù)據(jù)庫為根底，充分利用我國的臨床病人的資源，擴大數(shù)據(jù)庫規(guī)模，采用各種先進的手段，研究各型腦卒中和研究顱內(nèi)動脈狹窄的易感基因和遺傳標志物。說明腦卒中發(fā)生新的決定因素或影響因素，說明我國腦卒中的易感基因和遺傳標志物，為制定適合我國國情的針對腦卒中的早期預(yù)警和干預(yù)策略及防治方案提供科學(xué)依據(jù)，使腦血管疾病的發(fā)生率顯著降低。五年預(yù)期目標：確立1-2個有關(guān)腦卒中發(fā)生的新理論，用于指導(dǎo)腦血管疾病的防治；找出3-5個新的與腦卒中發(fā)生有關(guān)的靶分子，明確其功能及臨床意義；找出腦卒中各種亞型和顱內(nèi)動脈狹窄相應(yīng)的易感基因和遺傳標志物，力爭將它們連同上述新的靶分子一起用作腦卒中的預(yù)警指標；本工程實施中取得的根底性研究成果將在國際刊物上發(fā)表IF>5.0的SCI收錄文章50篇以上，其中IF>10的8篇，頂級雜志1-3篇；本工程實施中將培養(yǎng)博士生200名，爭取有4-8篇論文評上全國優(yōu)秀博士論文；培養(yǎng)年輕教師50名，爭取評上國家杰青4-8名；提升現(xiàn)有的腦血管病研究基地的學(xué)術(shù)地位，形成3-5個新的臨床與根底研究相結(jié)合的腦血管病研究基地。

三、研究方案總體研究方案本課題工程分為四個局部，以影響或決定腦卒中發(fā)生的因素為研究核心，將腦卒中有關(guān)的易感基因、神經(jīng)損傷機制、新技術(shù)和新方法以及新的活性化合物四方面的研究結(jié)合在一起。第一局部從血管外(全身性)因素(包括調(diào)節(jié)紊亂、代謝紊亂、炎癥反響等)、血管因素(血管重構(gòu))和血管內(nèi)因素(斑塊的穩(wěn)定性、血栓形成)，研究腦卒中發(fā)生的影響或決定因素；第二局部以腦卒中的臨床分型為根底，以顱內(nèi)動脈狹窄為重點，研究各型腦卒中和腦卒中的中間表型顱內(nèi)動脈狹窄的易感基因和遺傳標志物；第三局部為神經(jīng)損傷機制的研究，重點研究神經(jīng)血管單元；第四局部通過新方法、新技術(shù)和新的化合物，驗證防治腦卒中新的靶點，并為最終用于腦卒中的防治打下根底。這四個局部又可分成8小塊，相對應(yīng)于8個課題組的主要研究內(nèi)容，各局部之間緊密地聯(lián)系，并相互促進，圖示如下：易感基因易感基因驗證新靶點新技術(shù)新方法新化合物神經(jīng)血管單元研究管壁因素:血管重構(gòu)管內(nèi)因素:斑塊不穩(wěn)定驗證新靶點預(yù)測預(yù)防治療驗證新靶點新技術(shù)新方法新化合物神經(jīng)血管單元研究管壁因素:血管重構(gòu)管內(nèi)因素:斑塊不穩(wěn)定驗證新靶點預(yù)測預(yù)防治療全身因素:脂肪細胞因子全身因素:脂肪細胞因子全身因素:神經(jīng)調(diào)節(jié)、能量代謝第一局部腦卒中發(fā)生的決定或影響因素研究影響腦卒中發(fā)生的全身性因素擬采用兩種策略：撒網(wǎng)法和垂釣法。前者采用基因芯片、miRNA芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等手段，發(fā)現(xiàn)與腦卒中發(fā)生有關(guān)的靶分子(如下列圖左側(cè))。采用SHR-SP與SHR比擬，旨在排除高血壓因素，使差異更多地代表腦卒中。對找到的靶分子進行深入的研究，利用RNA干擾、轉(zhuǎn)基因治療、基因敲除等方法進行中間表型驗證和終點指標驗證。垂釣法根據(jù)我們以前的發(fā)現(xiàn)和某些文獻的啟示，選定一些可能的靶點或靶分子進行深入的研究。最終驗證該靶點或靶分子能否作為預(yù)防腦卒中的新靶點(如下列圖右側(cè))。SHR-SPvsSHRSHR-SPvsSHR基因敲除小鼠＋2K2CSHR-SP終點指標功能驗證(腦卒中的發(fā)生)中間表型功能驗證(炎癥，凋亡等)終點指標功能驗證(腦卒中的發(fā)生)中間表型功能驗證(炎癥，凋亡等)我們發(fā)現(xiàn)或文獻報道可能的靶點蛋白組學(xué)代謝組學(xué)RNA干擾基因治療RNA干擾基因敲除基因芯片miRNA芯片差異表達的靶分子基因治療基因轉(zhuǎn)移研究的創(chuàng)新性：(1)國外有用基因敲除小鼠研究該基因?qū)Υ竽X中動脈阻塞后神經(jīng)損傷(梗死面積)的影響。由于缺乏適宜的模型，無法觀察某種基因是否影響自發(fā)性腦卒中的發(fā)生。而要預(yù)防腦卒中，必須觀察對自發(fā)性腦卒中的影響。本工程建立了適合這種研究的動物模型，在該領(lǐng)域領(lǐng)先了一步；(2)我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)ABR功能、長壽基因Sirtuin、脂肪細胞因子Visfatin、IL6等有可能成為腦卒中預(yù)防的新靶點，經(jīng)過本工程的進一步深入研究，有可能確立其中幾個新靶點。影響腦卒中發(fā)生的血管因素研究方案見下列圖。在與人類高血壓相近的遺傳性易卒中自發(fā)性高血壓大鼠〔SHR-SP〕及非遺傳性易卒中雙腎雙夾高血壓大鼠〔RHR-SP〕模型上，采用斑片鉗單離子通道記錄,熒光影象動態(tài)測定單細胞胞漿Cl-及分子生物學(xué)等技術(shù),探討Cl-通道〔容積調(diào)節(jié)性/ClC-3及Ca2+激活Cl-通道〕與Ca2+通道〔ROC和SOC〕在高血壓開展過程中血管平滑肌細胞Cl-調(diào)控失平衡，腦血管重構(gòu)及其過程中細胞增殖，凋亡及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的內(nèi)在關(guān)系，以及在腦卒中發(fā)生過程中所起的作用及相關(guān)的分子機制,并探討通過他汀類等藥物干預(yù)后的影響。說明Cl-通道與Ca2+通道腦血管重構(gòu)，腦卒中發(fā)生過程的作用；為尋找作用新靶點用來防治高血壓血管重構(gòu)及其他并發(fā)癥的新藥予以佐證。研究的創(chuàng)新性：高血壓發(fā)病機理包含遺傳因素及非遺傳因素；本研究是在遺傳性易卒中自發(fā)性高血壓大鼠及非遺傳性易卒中腎性高血壓大鼠模型上同步進行，研究工作是在高血壓腦卒中開展過程中的不同階段動態(tài)進行,更能切實地反映出高血壓易卒中開展過程中的規(guī)律；本研究是通過易卒中高血壓大鼠整體實驗與離子/通道水平及基因表達實驗結(jié)合起來動態(tài)監(jiān)測高血壓開展過程中Ca2+與Cl-通道的功能與調(diào)節(jié)的變化以及與血管重構(gòu)，腦卒中的關(guān)系，故能更系統(tǒng)確切地揭示二者的內(nèi)在關(guān)系。WKYWKY大鼠SHR-SP〔遺傳性〕假手術(shù)組大鼠RHR-SP〔非遺傳性〕新鮮別離大腦中動脈，基底動脈容積依賴性Cl-通道特性和信號調(diào)控：RhoA-Rho激酶調(diào)節(jié)通路、酪氨酸磷酸化通路PKC調(diào)節(jié)新鮮別離腦血管平滑肌細胞+他汀類+Rd-他汀類-Rd腦血管重構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變〔光鏡，電鏡〕血管重構(gòu)標志物表達檢測〔免疫熒光〕培養(yǎng)的腦血管平滑肌細胞對細胞增殖及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響：ERKRhoA-Rho激酶調(diào)節(jié)通路細胞周期相關(guān)蛋白Ca2+激活Cl-通道特性和細胞Ca2+調(diào)控：不同類型Ca2+通道調(diào)節(jié)、CaMKII,calcineurin調(diào)節(jié)、通道分子根底ROC和SOC特性以及與：ROS生成的關(guān)系Cl-通道調(diào)控的關(guān)系細胞增殖信號通路的關(guān)系對細胞凋亡及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響：細胞色素C、Bcl-2BaxCaspase-3LaminA

及fodrin等凋亡相關(guān)蛋白細胞周期相關(guān)蛋白+他汀類-他汀類ClC-3轉(zhuǎn)染和siRNA干擾高血壓不同階段

影響腦卒中發(fā)生的血管內(nèi)機制研究方案如下列圖所示。建立小鼠頸總動脈斑塊動物模型，大鼠房顫抖物模型。針對易損斑塊破裂脫落導(dǎo)致遠端動脈閉塞，引起缺血性腦卒中。擬四方面研究影響腦卒中發(fā)生的血管內(nèi)機制：(1)說明27bpmiRNA對一氧化氮合成酶〔eNOS〕調(diào)節(jié)的分子機制以及血管內(nèi)皮細胞存活和凋亡的關(guān)鍵因子及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，了解它們在不穩(wěn)定斑塊的形成和開展中所起的作用。通過控制血管內(nèi)皮細胞的凋亡，糾正內(nèi)皮細胞的功能異常，以到達穩(wěn)定斑塊的目的；(2)從炎癥因子調(diào)節(jié)膠原合成代謝的有關(guān)途徑入手，探討炎癥因子介導(dǎo)膠原合成代謝的傳導(dǎo)通路及它們和血管已損斑塊的關(guān)系，以期通過控制炎癥因子來到達穩(wěn)定斑塊的目的。(3)探討Tim分子參與巨噬細胞活化的過程、巨噬細胞-T細胞相互作用的分子機制，明確Tim分子在血管不穩(wěn)定斑塊炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制中的地位，為抑制斑塊炎癥反響而到達穩(wěn)定斑塊提供新的靶點和治療途徑。(4)了解非瓣膜性房顫患者血小板功能、凝血及纖溶狀態(tài)的變化及其在止血和血栓形成過程中的作用，探討非瓣膜性房顫患者高發(fā)缺血性腦卒中的分子機理，為非瓣膜性房顫腦卒中的防治提供新思路。研究的創(chuàng)新性利用ApoE基因敲除、高脂喂養(yǎng)、內(nèi)皮損傷、脂多糖刺激和應(yīng)激狀態(tài)等多重因素，建立了最大程度模擬人不穩(wěn)定斑塊病變的動物模型；27bpmiRNA是我們首次報道的對eNOS表達有抑制作用的小RNA；構(gòu)建27sir-RNA表達載體(HueNOS-sir-RNA〕和含有eNOS基因cDNA全長的表達載體〔HueNOS-cDNA/nx27nt〕載體，轉(zhuǎn)入eNOS-/-老鼠的胚胎干細胞，產(chǎn)生出兩種基因型轉(zhuǎn)基因鼠，來研究miRNA在活體內(nèi)對eNOS基因表達的影響，屬于原創(chuàng)性工作；從血管內(nèi)皮細胞存活和凋亡這兩個方面的關(guān)鍵因子和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路入手，研究它們在不穩(wěn)定斑塊形成和破裂中的作用及其交互對話，在國內(nèi)外尚未見報道；首次提出血管炎癥中主要的炎性因子通過調(diào)節(jié)NonO,DJ-1的變化,來介導(dǎo)血管膠原合成代謝途徑,并影響斑塊穩(wěn)定性。提出非瓣膜性房顫患者體內(nèi)存在的高水平氧化應(yīng)激產(chǎn)物，使血小板外表CD36表達增加，并以CD36為受體，激活血小板，使患者形成高凝狀態(tài)或血栓前狀態(tài)，并最終引起缺血性腦卒中，是新的研究思路。第二局部腦卒中各亞型和顱內(nèi)動脈狹窄的易感基因研究腦卒中各亞型的易感基因研究腦卒中分缺血型和出血型腦卒中。缺血性腦卒中又可分成以下幾類：動脈粥樣硬化性大血管閉塞(流域性腦梗死)；動脈源性腦栓塞；低灌注性腦梗死；心源性腦栓塞；腔隙性腦梗死；其他機制；混合性；發(fā)病機制不明。一級評價(所有病人都必須有的檢查)包括：腦影像：頭顱CT和MRI；腦供血動脈：TCD、頸動脈彩超、MRA；其他血管床：腎動脈彩超、ABI；相關(guān)血液化驗：血糖、LDL、HDL、HCY、CRP和一般資料的收集和登記；二級評價包括：主動脈弓斑塊檢查；PFO篩查(TCD發(fā)泡試驗，經(jīng)食道超聲)；TCD微栓子監(jiān)測；腦血流動力學(xué)檢查和頭PWI/CT灌注；三級評價包括：心臟MRA；雙腎及雙下肢MRA；超聲頸動脈彈性檢查；磁共振頸動脈血流分析；頭SWI(微出血)；DTI/T2(小血管病定量分析)。具體流程如下列圖。到2021年5月，我們已經(jīng)建立了由20000例病人組成的數(shù)據(jù)庫。本工程擬選擇出血型腦卒中、動脈源性腦栓塞、低灌注性腦梗死、心源性腦栓塞、腔隙性腦梗死等5種主要類型的腦卒中，每種200例，進行全基因組關(guān)聯(lián)研究。患者就診患者就診病因＋發(fā)病機制＋對癥治療初步評價病因＋發(fā)病機制＋對癥治療初步評價發(fā)病機制明確預(yù)后評估故預(yù)后評估故一級評價全基因組關(guān)聯(lián)研究以發(fā)病機制為根底的腦卒中分型數(shù)據(jù)庫預(yù)后評估故發(fā)病機制不明二級評價發(fā)病機制明確病因＋發(fā)病機制＋對癥治療初步評價預(yù)后評估故三全基因組關(guān)聯(lián)研究以發(fā)病機制為根底的腦卒中分型數(shù)據(jù)庫預(yù)后評估故發(fā)病機制不明二級評價發(fā)病機制明確病因＋發(fā)病機制＋對癥治療初步評價預(yù)后評估故三級評價發(fā)病機制明確病因＋發(fā)病機制＋對癥治療初步評價預(yù)后評估故發(fā)病機制不明發(fā)病機制不明再次評價對癥治療高血壓患者中無病癥性顱內(nèi)動脈狹窄的篩查及其危險因素研究原發(fā)性高血壓，無腦卒中史及臨床病癥和體征，男女不限。完成顱內(nèi)動脈CTA檢查1000-1500例。血管狹窄程度>50%判定為顱內(nèi)動脈狹窄。心血管危險因素的檢查和紀錄：包括根本信息；高血壓病程；血壓水平和服用降壓藥物史；個人史；家族史等；體格檢查；生化檢查；局部對象進行高血壓相關(guān)靶器官損害的檢查。所有對象簽署知情同意書，取外周血抽提基因組DNA。選取顱內(nèi)動脈狹窄：300-500例，顱內(nèi)動脈正常：300-500例?；驋呙瑁翰捎肐lluminaHumanHap500SNP基因芯片。隨訪研究：對進入研究的2組所有對象(600-1000例)進行平均為期3年的隨訪。隨訪結(jié)束時，重復(fù)1次CTA和心血管危險因素檢查。通過前瞻性研究分析，驗證上述研究中發(fā)現(xiàn)的基因位點及心血管危險因素與顱內(nèi)動脈狹窄的發(fā)生、開展及進展為缺血性腦卒中之間的因果關(guān)系(見下列圖)。研究的創(chuàng)新點：建立前瞻性、大樣本缺血性腦卒中發(fā)病機制分型數(shù)據(jù)庫，針對不同發(fā)病機制分型的腦卒中進行生化標記物和易感基因研究，有利于發(fā)現(xiàn)各型腦卒中的易感基因，大幅度提高腦卒中預(yù)測的有效性；顱內(nèi)動脈狹窄的GWA研究,為一原創(chuàng)性研究。與已發(fā)表的缺血性腦卒中的GWA研究比擬，本研究采用CTA證實的顱內(nèi)動脈狹窄作為缺血性腦卒中的理想中間表型，這一研究思路具有創(chuàng)新性，且符合國人特點。研究樣本的均一性將明顯好于該研究。此外，在樣本量和掃描SNP的數(shù)量方面，本研究也均超過該研究。在GWA研究的根底上進行隨訪，通過隊列研究進一步證實橫斷面研究結(jié)果，在GWA研究上未見報道。第三局部腦卒中神經(jīng)損傷和神經(jīng)保護的研究研究方案如下列圖所示。建立腦卒中的整體和細胞模型，針對神經(jīng)血管單元和腦卒中神經(jīng)損傷的復(fù)雜級聯(lián)反響開展系統(tǒng)研究，說明神經(jīng)損傷的細胞與分子機制，發(fā)現(xiàn)與腦卒中神經(jīng)損傷高度相關(guān)的重要基因、受體、通道、蛋白、關(guān)鍵信號分子；應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)知識與技術(shù)，探索增強的內(nèi)源性神經(jīng)保護的途徑和新的內(nèi)源性神經(jīng)保護通路及其調(diào)節(jié)規(guī)律；應(yīng)用基因敲除技術(shù)，建立靶向性的生物模型〔整體和細胞模型〕，予以研究、佐證。建立MCAO動物模型建立氧糖剝奪等建立MCAO動物模型建立氧糖剝奪等細胞模型星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)元小膠質(zhì)細胞血管內(nèi)皮細胞針對神經(jīng)-血管單元的研究興奮性毒性機制神經(jīng)炎性機制細胞凋亡機制神經(jīng)再生障礙針對損傷級聯(lián)反響的研究發(fā)現(xiàn)與腦卒中神經(jīng)損傷高度相關(guān)的重要基因、受體、通道、蛋白、關(guān)鍵信號分子發(fā)現(xiàn)針對神經(jīng)損傷復(fù)雜病理機制中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的神經(jīng)保護新靶點及其內(nèi)源性神經(jīng)保護新途徑應(yīng)用基因敲除技術(shù)建立靶向性的生物模型從整體、細胞和分子水平，系統(tǒng)研究、說明神經(jīng)血管單元在腦卒中神經(jīng)損傷中的作用及其相互調(diào)節(jié)，有益于揭示與腦卒中神經(jīng)損傷高度相關(guān)的復(fù)雜多元病理機制，為研發(fā)理想的多潛能神經(jīng)保護劑提供有益的靶標。應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)的集成技術(shù)與方法，不僅有益于研究、說明腦卒中神經(jīng)損傷級聯(lián)反響的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也有益于探索增強機體內(nèi)源性神經(jīng)保護的途徑，發(fā)現(xiàn)新的潛在的神經(jīng)保護通路及其調(diào)節(jié)機制。第四局部新技術(shù)、新方法和新化合物在腦卒中研究和防治中的應(yīng)用新技術(shù)、新方法主要反映在轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺。利用該技術(shù)平臺，除了要配合其他課題組的需要外，本課題組本身的研究有以下幾方面。動脈粥樣硬化是腦卒中的主要原發(fā)病，StAR是肝臟去除膽固醇次要途徑的限速蛋白。申請者發(fā)現(xiàn)肝臟StAR轉(zhuǎn)基因可降低肝臟和血液的脂質(zhì)含量，減少主動脈壁脂質(zhì)斑塊。有望降低腦卒中的發(fā)病率和嚴重程度。由于是預(yù)防性治療，基因載體將選用我們常規(guī)應(yīng)用的低度高效能介導(dǎo)基因長期表達的AAV1做為基因載體。血管內(nèi)皮細胞表達StAR，給腦動脈直接轉(zhuǎn)染StAR，降低腦動脈壁脂質(zhì)沉積，減少和穩(wěn)定斑塊，降低腦卒中的發(fā)病率和嚴重程度。IL-10、NDRG2或NOGO-B是內(nèi)源性血管保護因子，可能通過保護腦血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)平滑肌增殖、拮抗炎癥等方面的作用，減輕血管病變，減少再卒中的發(fā)生率。因此研究用這些內(nèi)源性血管保護因子轉(zhuǎn)基因預(yù)防腦卒中的可行性，并進一步探討保護基因在腦血管疾病中的功能機制，具有重要的理論和實際意義。新化合物主要反映在化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺。目前我們已經(jīng)利用500種常用中藥建立了含40000個中草藥小分子組分〔平均每個組分含11個單體化合物〕的天然化合物庫。除了要配合其他課題組的需要外，本課題組首先要研究的靶分子有：AQP4阻斷劑，Sirtuin沖動劑，酸敏感通道ASIC1的阻斷劑等。創(chuàng)新點與特色：首次通過基因治療手段提高體內(nèi)原本存在但作用不明顯的去除脂質(zhì)的機制，到達預(yù)防腦卒中的目的；首次用減毒病毒載體介導(dǎo)腦卒中的轉(zhuǎn)基因干細胞治療；首次進行針對腦卒中后缺血再灌注損傷和炎癥的轉(zhuǎn)基因干細胞治療；首次針對腦卒中后產(chǎn)生的對干細胞有調(diào)節(jié)作用的細胞因子/化學(xué)因子網(wǎng)絡(luò)進行篩選，尋找有望成為轉(zhuǎn)基因干細胞治療靶基因的因子并進行驗證；我們建立的天然藥物庫與眾不同的特點有兩點。一是涵蓋面廣，基于有效中草藥的各種成分都不遺漏，特別是一些含量低的活性成分；二是效率高，能很快地得到有效單體化合物；本工程擬研究的AQP4阻斷劑，Sirtuin沖動劑，酸敏感通道ASIC1的阻斷劑等對腦卒中的防治作用都是作用于新的靶點的新化合物。課題設(shè)置本工程的課題設(shè)置分為八個局部，分別研究影響腦卒中發(fā)生的全身性因素(2個課題組)、血管因素(血管重構(gòu))和管內(nèi)因素(斑塊的穩(wěn)定性)、研究腦卒中的易感基因和遺傳標志物、研究神經(jīng)損傷和神經(jīng)保護機制、研究新方法、新技術(shù)和新的天然活性化合物在腦卒中研究和防治中的應(yīng)用(2個課題組)。各個課題在研究中各有側(cè)重，但在腦卒中的預(yù)測、預(yù)防和治療的各個環(huán)節(jié)中又互相聯(lián)系，互相促進。課題一：神經(jīng)調(diào)節(jié)、能量代謝等在腦卒中發(fā)生中的作用負責(zé)人：蘇定馮54歲，教授，博士生導(dǎo)師，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：陳豐原46歲，長江講座教授，博士生導(dǎo)師，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院戴生明38歲，副教授，碩士生導(dǎo)師，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院研究目標：確立對腦卒中的發(fā)生起決定性作用的靶系統(tǒng)一個、靶分子2-3個，并說明其作用機理，為作為預(yù)防腦卒中的干預(yù)靶點提供根底研究的證據(jù)。緊密聯(lián)系臨床，確定影響我國腦血管疾病發(fā)病的各種全身性的關(guān)鍵危險因素，為制定適合我國國情的針對腦卒中的早期預(yù)警和干預(yù)策略及防治方案提供科學(xué)依據(jù)。發(fā)表SCI論文，總IF>100,其中IF>5.0的論文10篇以上，IF>10的論文2-3篇，爭取在頂級雜志發(fā)表1篇，培養(yǎng)全國優(yōu)博1-3名、國家杰青1-2名。研究內(nèi)容：主要影響腦卒中發(fā)生的全身性因素。(1)建立動物模型：對于腦卒中的動物實驗大局部采用大腦中動脈阻塞，觀察腦損傷情況。如果要對預(yù)防腦卒中的作用進行評價，必須使用自發(fā)性腦卒中動物模型。大鼠有遺傳性的SHR-SP，但無法用于小鼠，這是個世界性難題。因此，建立小鼠自發(fā)性腦卒中動物模型十分必要，以便能使用基因敲除小鼠來研究自發(fā)性腦卒中的發(fā)生；(2)針對ABR功能。用7基因剔除小鼠研究ABR功能低下導(dǎo)致腦卒中易發(fā)的7機制；用我們自己培育的全世界唯一的自發(fā)性ABR功能缺陷大鼠進一步研究ABR功能與腦卒中的關(guān)系；尋找改善ABR功能的藥物，用于腦卒中的預(yù)防；(3)針對熱量限制。用Sirt1基因敲除小鼠和慢病毒RNA干擾，研究限食延緩腦卒中的Sirtuin機制；從天然化合物中篩選Sirt1沖動劑并用于腦卒中的預(yù)防；熱量限制發(fā)揮腦卒中保護作用的其他機制研究，包括雌激素受體機制、ABR功能改善機制等；(4)針對其他因素。通過蛋白質(zhì)組學(xué)、基因芯片、代謝組學(xué)和miRNA芯片等手段，用SHR-SP和普通的SHR進行比擬(以利于去除高血壓引起的差異)，找出差異，進行深入的研究。比方我們發(fā)現(xiàn)SHR-SP大腦中的醛脫氫酶顯著低于SHR，該酶的產(chǎn)物之一dopac降低。我們將研究：首先醛脫氫酶是怎樣降低的，其次研究醛脫氫酶降低的后果(底物dopal是一種醛，有細胞毒性)，是否與腦卒中的發(fā)生有關(guān)。另外，與王擁軍教授課題組進行病人的易感基因或致病基因的研究，采用全基因掃描技術(shù)，用含近100萬和SNP的芯片測定SNP多態(tài)性。占整個工程經(jīng)費比例：17%課題二：脂肪細胞因子在腦卒中發(fā)生中的作用負責(zé)人：繆朝玉42歲，教授，博士生導(dǎo)師，國家杰出青年基金獲得者，全國優(yōu)秀博士論文獲得者，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：郭振紅31歲，副教授，碩士生導(dǎo)師，全國優(yōu)秀博士論文獲得者，第二軍醫(yī)大學(xué)根底醫(yī)學(xué)部袁文俊65歲，教授，博士生導(dǎo)師，第二軍醫(yī)大學(xué)根底醫(yī)學(xué)部沈甫明40歲，副教授，碩士生導(dǎo)師，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院研究目標：確定腦卒中防治新靶標1-3個，并說明其作用機理，為腦卒中發(fā)生提供新的見解，為腦卒中防治的新藥開展積累根底。同時，為制定適合我國國情的針對腦卒中的早期預(yù)警和干預(yù)策略及防治方案提供科學(xué)依據(jù)。發(fā)表SCI論文，IF>5.0的論文6-8篇，IF>10的論文1-3篇，培養(yǎng)優(yōu)秀科技人才(全國優(yōu)博或國家杰青)1名。研究內(nèi)容：〔1〕研究脂肪細胞因子visfatin能否成為腦卒中防治的新靶標。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，visfatin對腦組織具有內(nèi)源性保護作用。本工程擬在前期研究根底上，進一步在病人和動物模型上研究visfatin與腦卒中的關(guān)系，以及在動物和細胞模型上采用適宜的干預(yù)手段，如：visfatin重組蛋白、特異性酶抑制劑FK866、酶產(chǎn)物NMN、抗體、基因overexpression和knockdown，研究visfatin在腦卒中發(fā)生開展中的作用?！?〕尋找有效調(diào)節(jié)脂肪細胞因子visfatin表達/活性的天然化合物。新型天然先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)對促進根底理論研究和自主創(chuàng)新藥物開展均至關(guān)重要。分子水平、高靈敏度的高通量篩選方法有助于快速、準確地發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物。本工程擬建立完整、標準、穩(wěn)定的高通量篩選系統(tǒng)，利用本院和第八課題組的天然化合物庫資源，篩選能上調(diào)visfatin表達/活性的先導(dǎo)化合物。研究其對腦卒中的防治療效和機制，一方面以進一步確認靶標，另一方面為開展自主創(chuàng)新藥奠定根底?！?〕研究脂肪細胞因子/炎癥因子IL-6等在腦卒中發(fā)生中的作用。用易卒中大鼠SHR-SP與SHR比擬，觀察各組織和血清中炎癥因子(或與炎癥反響有關(guān)的因子)的差異表達。對差異表達明顯的因子的相應(yīng)基因進行測序，觀察DNA有無突變位點，進一步研究該突變位點對蛋白表達有無影響。用基因敲除小鼠，制成2腎2夾自發(fā)性腦卒中模型，觀察IL-6等在腦卒中發(fā)生中的作用?！?〕發(fā)現(xiàn)新的脂肪細胞因子，研究其對血管、腦細胞的作用，確認其能否成為腦卒中防治新靶標。擬采用兩種策略。一是采用目標假定策略，將研究動脈粥樣硬化相關(guān)基因LIGHT、淋巴毒素等是否為新的脂肪細胞因子基因，目前我們已檢測到這兩種基因在腸系膜脂肪組織中的特異性高表達；二是采用基因芯片差異篩選策略來發(fā)現(xiàn)新的脂肪細胞因子，目前我們已在正常和限食大鼠模型上做了12張全基因芯片，以比擬三種脂肪組織(主動脈外膜脂肪、腸系膜脂肪、皮下脂肪)的差異表達，以及限食大鼠與正常自由飲食大鼠的差異表達，從中尋找新的脂肪細胞因子，并進行靶標確認研究。占整個工程經(jīng)費比例：12%課題三：氯離子通道在腦血管重構(gòu)和腦卒中發(fā)生中的作用負責(zé)人：關(guān)永源61歲，教授，博士生導(dǎo)師，中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：段大躍49歲，教授，博士生導(dǎo)師，中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院周家國37歲，副教授，碩士生導(dǎo)師，全國優(yōu)秀博士論文獲得者，中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院王冠蕾35歲，副教授，碩士生導(dǎo)師，中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究目標：通過研究為進一步說明腦卒中與腦血管重構(gòu)發(fā)生的機理，從Ca2＋/Cl-離子通道新角度提供新的資料，為預(yù)防腦卒中提出新思路，也為尋找作用于新靶點、用來防治腦血管重構(gòu)及腦卒中的新藥提供理論依據(jù)。研究工作將在國際雜志發(fā)表論文約30篇，其中SCI影響因子5.0以上6-8篇，SCI影響因子10.0以上的1-3篇。研究內(nèi)容：用SHR-SP及2腎2夾腎血管性高血壓大鼠研究氯離子通道和鈣離子通道在腦血管重構(gòu)中的作用：(1)Ca2+激活Cl-通道。探討在高血壓腦血管重構(gòu)過程中及腦卒中發(fā)生的腦血管平滑肌細胞Ca2+激活Cl-通道活性與調(diào)節(jié)的變化，以及與Ca2+調(diào)控之間的關(guān)系；探討bestrophin蛋白與Ca2+激活Cl-通道的關(guān)系及其對腦血管平滑肌細胞表型改變和高血壓腦血管重構(gòu)/腦卒中影響；(2)容積調(diào)節(jié)/ClC-3Cl-通道。研究高血壓腦血管重構(gòu)/腦卒中腦血管平滑肌細胞該通道的功能及調(diào)節(jié)通路變異；建立靶向敲除血管平滑肌ClC-3動物模型，在此根底上建立相應(yīng)野生型動物高血壓模型，在基因水平比擬ClC-3對腦血管重構(gòu)的影響；研究ClC-3對腦血管平滑肌細胞增殖/凋亡調(diào)節(jié)機理；確定ClC-3功能型酪氨酸磷酸化位點；研究ClC-3-ROS在腦卒中發(fā)生所扮演的角色；以及endophilin與容積調(diào)節(jié)/ClC-3Cl-通道關(guān)系,以及與高血壓腦血管重構(gòu)/腦卒中腦血管平滑肌細胞容積調(diào)節(jié)/ClC-3Cl-通道功能變異中的相關(guān)性；(3)Ca2+通道。研究在腦血管重構(gòu)及腦卒中發(fā)生過程腦血管平滑肌細胞ROC/SOC功能變化；探討endophilin與腦血管平滑肌細胞ROC及SOC的關(guān)系；研究ROC/SOC對腦血管平滑肌細胞增殖/凋亡及ROS生成作用與機理；觀察特異性阻斷ROC/SOC的人參皂甙單體Rd干預(yù)后對腦血管重構(gòu)腦卒中的作用及相關(guān)作用機理。占整個工程經(jīng)費比例：11%課題四：斑塊穩(wěn)定性和血栓形成的分子機制與腦卒中預(yù)防新靶點的研究負責(zé)人：張銘湘41歲，教授，博士生導(dǎo)師，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：張澄29歲，博士，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院張蔚53歲，教授，博士生導(dǎo)師，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院馬春紅39歲，教授，博士生導(dǎo)師，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院研究目標：說明腦卒中發(fā)生的血管內(nèi)因素，找出1-3個新的與動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性或血栓形成有關(guān)的靶分子，驗證它們作為預(yù)防腦卒中干預(yù)靶點的可能性。培養(yǎng)1-2名國家杰出青年基金獲得者，5-10名博士后，15-20名博士生。形成一支國家級科研創(chuàng)新團隊。在SCI雜志發(fā)表論文總IF>80,其中IF>3.0的論文15篇以上，IF>5.0的論文7篇。研究內(nèi)容：說明血管炎癥與腦血管斑塊穩(wěn)定性,特別是與膠原合成代謝之間的分子和細胞機制，通過干預(yù)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路及轉(zhuǎn)錄因子增加斑塊的穩(wěn)定性；說明血管內(nèi)皮細胞的功能紊亂和凋亡與NO和NO合成酶〔eNOS〕表達調(diào)控的機理及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；明確Tim在巨噬細胞和T淋巴細胞活化過程中的信號傳導(dǎo)通路；明確高血壓對血管壁細胞凋亡通路〔PI3K/Akt/Foxo3a〕的影響、高血壓對斑塊內(nèi)出血的影響、紅細胞裂解成分對基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的影響和結(jié)合珠蛋白－CD163系統(tǒng)對血管壁動脈粥樣硬化的影響，找出腦卒中可能的干預(yù)靶點；說明血小板活化機制以及斑塊性質(zhì)和非瓣膜性房顫與腦卒中之間的相互作用的分子機理，找出干預(yù)血小板活化的關(guān)鍵和有效靶點；確定與腦卒中發(fā)生和開展密切相關(guān)的基因和蛋白。找出符合我國人群腦卒中發(fā)病特點的疾病早期生物標志物，建立靈敏的早期診斷方法。占整個工程經(jīng)費比例：11%課題五：中國人各型腦卒中和顱內(nèi)動脈狹窄的易感基因研究負責(zé)人：王擁軍45歲，教授，博士生導(dǎo)師，首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院學(xué)術(shù)骨干：朱鼎良64歲，教授，博士生導(dǎo)師，上海交通大學(xué)瑞金醫(yī)院姜衛(wèi)劍48歲，教授，主任醫(yī)師，首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院高山44歲，教授，主任醫(yī)師，協(xié)和醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)院羅玉敏43歲，教授，主任醫(yī)師，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院趙性泉43歲，副教授，主任醫(yī)師，首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院董可輝50歲，副主任醫(yī)師，首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院高培毅56歲，教授，主任醫(yī)師，首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院康熙雄56歲，教授，首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院朱理敏39歲，哲學(xué)博士，上海交通大學(xué)瑞金醫(yī)院張怡34歲，副研究員，上海交通大學(xué)瑞金醫(yī)院研究目標：建立包括20000例腦卒中病例的人口學(xué)信息、臨床分型特征、實驗室檢查、輔助檢查、治療及預(yù)后等信息的登記數(shù)據(jù)庫；建立以病因和發(fā)病機制為根底的腦卒中分型標準和標準診治體系，形成具體操作標準、臨床路徑、指導(dǎo)文件、工具、軟件等可考核技術(shù)標準，按照標準的腦卒中分型診治標準，前瞻性連續(xù)入選腦卒中病例5000例，建立以病因和發(fā)病機制為根底的腦卒中分型數(shù)據(jù)庫，說明不同腦卒中亞型的臨床及預(yù)后特征；完成600例〔包括300例變性性小血管病腦卒中患者和300例非腦卒中對照組患者〕的全基因掃描，識別與變性性小血管病腦卒中亞型相關(guān)的SNP位點；完成600例〔包括顱內(nèi)動脈狹窄組和顱內(nèi)動脈正常組各300例〕的全基因組SNP掃描，識別與顱內(nèi)動脈狹窄相關(guān)的SNP位點。說明在高血壓患者中發(fā)生顱內(nèi)動脈狹窄的危險因素；充分發(fā)揮課題的平臺作用，培養(yǎng)腦卒中臨床與根底合作的多學(xué)科團隊；發(fā)表SCI論文10篇以上，培養(yǎng)學(xué)科帶頭人1-2名，博士后1-2名，博士研究生和碩士研究生10名。研究內(nèi)容：通過對含人口學(xué)特征、臨床分型特征、實驗室檢查、輔助檢查、治療及預(yù)后等信息的臨床登記數(shù)據(jù)庫進行整理分析，結(jié)合專家討論，建立和完善以病因和發(fā)病機制為根底的腦卒中分型標準和腦卒中分型標準診治體系，按照標準化的分型診斷、標本留取、治療和預(yù)后評估流程，前瞻性連續(xù)入選腦卒中患者，建立以病因和發(fā)病機制為根底的腦卒中分型數(shù)據(jù)庫、血標本庫和基因庫，研究比擬不同病因和發(fā)病機制亞型腦卒中患者的臨床暴露特征與預(yù)后關(guān)系；通過單基因掃描和全基因組關(guān)聯(lián)研究，探索各腦卒中亞型的易感基因。通過顱內(nèi)動脈的血管造影〔CTA〕對高血壓患者中無病癥性顱內(nèi)動脈狹窄的篩查及其危險因素分析，為全基因組關(guān)聯(lián)研究〔GWA〕提供樣本，并說明高血壓患者發(fā)生顱內(nèi)動脈狹窄的危險因素。開展顱內(nèi)動脈狹窄的全基因組關(guān)聯(lián)研究，識別國人高血壓患者中與顱內(nèi)動脈狹窄相關(guān)的基因SNP位點。通過為期3-5年的隨訪研究，進一步驗證上述研究發(fā)現(xiàn)的基因位點及心血管危險因素在顱內(nèi)動脈狹窄發(fā)生、開展中的作用。占整個工程經(jīng)費比例：15%課題六：腦卒中神經(jīng)損傷與神經(jīng)保護機制研究負責(zé)人：胡剛47歲，教授，博士生導(dǎo)師，國家杰出青年基金獲得者，南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)骨干：徐運47歲，教授，博士生導(dǎo)師，南京醫(yī)科大學(xué)卞勁松41歲，教授，博士生導(dǎo)師，南京醫(yī)科大學(xué)楊儉47歲，教授，博士生導(dǎo)師，南京醫(yī)科大學(xué)研究目標：基于神經(jīng)-血管單元和神經(jīng)-膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，研究、說明腦卒中神經(jīng)損傷的一些關(guān)鍵病理機制，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護的新途徑，為腦卒中神經(jīng)損傷的治療學(xué)突破和研發(fā)多潛能神經(jīng)保護劑提供新的靶標；根據(jù)學(xué)術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的靶點，設(shè)計、合成或從天然產(chǎn)物中獲得假設(shè)干個靶向性神經(jīng)保護先導(dǎo)物，申請專利2-3項；發(fā)表高影響力的研究論文：IF>5.0的SCI論文5-8篇，其中IF>10.0的SCI論文1-2篇；培養(yǎng)國家杰出青年科學(xué)基金或全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文獲得者1-2人，通過工程實施，建成在針對腦卒中神經(jīng)保護研究領(lǐng)域富有國際學(xué)術(shù)競爭力的優(yōu)秀研究團隊。研究內(nèi)容：(1)系統(tǒng)研究神經(jīng)-血管單元在腦卒中神經(jīng)損傷中的作用及其相互調(diào)節(jié)，說明腦卒中神經(jīng)損傷的關(guān)鍵病理機制，為臨床治療學(xué)的突破提供有益的思路與策略；(2)發(fā)現(xiàn)與腦卒中神經(jīng)損傷復(fù)雜級聯(lián)反響高度相關(guān)的基因、受體、離子通道、酶或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，為研發(fā)理想的多潛能神經(jīng)保護劑提供新的靶點；(3)應(yīng)用蛋白組學(xué)知識與技術(shù)，探索增強的內(nèi)源性神經(jīng)保護的途徑，發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)源性神經(jīng)保護通路及其調(diào)節(jié)規(guī)律；(4)研究、說明腦卒中損傷進程中神經(jīng)再生障礙的細胞與分子機制，探索促神經(jīng)再生在腦卒中神經(jīng)損傷治療中的應(yīng)用及其學(xué)術(shù)根底；(5)根據(jù)學(xué)術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的新靶點，設(shè)計、合成或從天然產(chǎn)物中獲得靶向性神經(jīng)保護先導(dǎo)物，為開展自主創(chuàng)新的神經(jīng)保護劑積累根底。占整個工程經(jīng)費比例：13%課題七：新方法和新技術(shù)在腦卒中研究和防治中的應(yīng)用負責(zé)人：陳思峰44歲，教授，博士生導(dǎo)師，復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：周向軍44歲，教授，博士生導(dǎo)師，上海交通大學(xué)藥學(xué)院陳紅44歲，教授，博士生導(dǎo)師，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院段俊麗46歲，教授，碩士生導(dǎo)師，上海交通大學(xué)新華醫(yī)院研究目標：用基因治療手段提高原本存在但次要的能將血脂去除出體外或者動脈壁的途徑，到達降低腦卒中發(fā)生率的目的；檢驗和探討血管保護性基因和腦血管新功能基因轉(zhuǎn)基因治療對再卒中的防治作用；檢驗具有抗炎、抗凋亡和促血管新生功能的保護性基因如IL-10、IGF-1轉(zhuǎn)基因防治腦卒中的可行性；為其他課題組提供轉(zhuǎn)基因的技術(shù)平臺。在國際高水平雜志上發(fā)表研究論文，課題完成后獲得一項國家科技進步獎，建設(shè)世界一流的研究團隊和專業(yè)實驗室。發(fā)表SCI論文25篇左右，其中IF因子10分以上3-4篇，5-10分8-10篇。培養(yǎng)研究生22-28名，博士后6名。研究內(nèi)容：基因治療對腦卒中的預(yù)防作用。靜脈給SHR-SP大鼠注射帶類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)的I型腺相關(guān)病毒載體(AAV1-StAR)，或SHR-SP腦動脈轉(zhuǎn)染攜帶StAR、IL-10、NDRG2或NOGO-B的AAV1病毒載體，觀察腦動脈粥樣硬化的形成、腦動脈張力、腦卒中發(fā)生率和嚴重程度；給實驗性腦卒中大鼠尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)，或事先轉(zhuǎn)染攜帶IL-10或IGF-1的減毒腺病毒的MSC，觀察其對腦缺血后再灌注損傷與炎癥、邊緣區(qū)細胞和轉(zhuǎn)基因細胞本身的轉(zhuǎn)歸、血管重構(gòu)、血管新生以及大鼠神經(jīng)功能與行為障礙的影響；用實時PCR列陣、多因子酶標檢測法從病灶組織中篩選出腦卒中時表達增加或者減少最明顯的5種對炎癥有調(diào)節(jié)作用的細胞因子或化學(xué)因子，制備相應(yīng)的帶表達上調(diào)基因的Ad載體或者表達下調(diào)基因SiRNA的Ad，分別轉(zhuǎn)染MSC并用于腦卒中實驗性治療，以獲得1-2個新的靶點基因。配合其他課題組，提供轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺。占整個工程經(jīng)費比例：10%課題八：新的天然活性化合物在腦卒中研究與防治中的應(yīng)用負責(zé)人：麻彤輝45歲，長江特聘教授，博士生導(dǎo)師，國家杰出青年基金獲得者，東北師范大學(xué)生命科學(xué)院學(xué)術(shù)骨干：芮耀誠65歲，教授，博士生導(dǎo)師，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院楊紅40歲，教授，博士生導(dǎo)師，東北師范大學(xué)生命科學(xué)院研究目標：從1000種常用中藥出發(fā)建立一個含有80000個成分簡單的天然藥物庫，并通過改良化學(xué)別離方法提高該天然藥物庫的質(zhì)量，使之在發(fā)現(xiàn)對新型腦卒中治療靶點的天然活性物質(zhì)方面發(fā)揮重要作用。獲得一系列針對所列腦卒中發(fā)生和防治新靶點的天然活性化合物。利用這些化合物作為某些靶分子的沖動劑或拮抗劑，起到小分子探針的作用，探討該靶分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在針對腦卒中新靶點的化學(xué)生物學(xué)和藥理學(xué)研究方面發(fā)表IF>5的文章5篇以上。研究內(nèi)容：完善基于高通量篩選的現(xiàn)有天然藥物發(fā)現(xiàn)平臺。目前我們已經(jīng)從500種常用中藥建立了含40000個中藥小分子組分的天然藥物庫。擬將該天然藥物庫的規(guī)模擴大至1000種常用中藥的天然藥物庫。用類似方法建立一個模式動物正常大腦組織和腦卒中大腦組織小分子組分庫，通過高效液相色譜和質(zhì)譜分析比擬腦卒中發(fā)生后大腦組織中小分子物質(zhì)的變化特征，尋找可能與腦卒中病理機制密切相關(guān)的小分子活性物質(zhì)。通過改良化學(xué)別離方法提高天然藥物庫的質(zhì)量。對AQP4阻斷劑，Sirtuin沖動劑，酸敏感通道ASIC1的阻斷劑等進行篩選。用獲得的新的高效天然活性化合物進行腦卒中機理和治療研究。占整個工程經(jīng)費比例：11%

四、年度方案年度研究內(nèi)容預(yù)期目標第一年1制備RHMSP、ABRDR動物模型；開展ABR功能與腦卒中關(guān)系研究；研究脂肪因子visfatin、炎癥因子IL-6與腦卒中的關(guān)系及其機制，對脂肪組織基因芯片數(shù)據(jù)分析、驗證；探討在高血壓腦血管重構(gòu)及腦卒中過程中腦血管平滑肌細胞Cl-通道功能與調(diào)節(jié)的變化以及他汀類藥物的影響。建立AS不穩(wěn)定斑塊病變的動物模型，構(gòu)建所需的基因載體及慢病毒包裝，收集臨床病例。2建立以病因和發(fā)病機制為根底的腦卒中分型標準和標準操作流程，前瞻性入選600例腦卒中分型病例和100例非腦卒中對照組受試者；在1000例原發(fā)性高血壓患者中開展顱內(nèi)動脈CTA檢查及心血管危險因素的檢查。3研究腦卒中神經(jīng)損傷進程中神經(jīng)-血管單元的功能變化及其相互調(diào)節(jié)4制備相關(guān)病毒載體，給SHR-SP的腦動脈轉(zhuǎn)染AAV1-IL-10、AAV1-IGF-1，檢驗血管保護性基因轉(zhuǎn)基因防治腦卒中的可行性及其機制；完善基于高通量篩選的現(xiàn)有化學(xué)生物學(xué)平臺；腦卒中相關(guān)藥靶的高通量篩選模型的建立及優(yōu)化。1完善動物模型，初步說明ABR功能預(yù)防腦卒中的機制；確定visfatin、IL-6的抗腦卒中作用和機制;visfatin活性化合物篩選模型初步建成;尋找SHR-SP的IL-6基因特異性SNP位點;確定潛在的新的脂肪細胞因子的研究目標;說明Cl-通道對高血壓腦血管重構(gòu)的影響以及他汀類藥物對腦血管重構(gòu)的作用及分子根底。建立具有多重危險因素、最大程度模擬人類AS不穩(wěn)定斑塊病變的動物模型2形成腦卒中分型診治的具體操作標準等可考核技術(shù)標準，建立腦卒中分型患者的診治、信息登記、以及血標本和DNA留取平臺;鑒定表型正確的高質(zhì)量的高血壓顱內(nèi)動脈狹窄及對照樣本。3說明膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞及其胞外間質(zhì)系統(tǒng)的功能狀態(tài)決定著腦卒中神經(jīng)元損傷的進程、程度和轉(zhuǎn)歸，膠質(zhì)細胞功能的改變是腦卒中神經(jīng)損傷的核心病理。4說明IL10，IFG-1治療腦卒中的可行性及其機制;完成100種常用中草藥、50種抗腦卒中中草藥組分的建庫工作；局部完成AQP4的阻斷劑、PAI-1抑制劑中藥組分的篩選。進一步獲得高活性單體化合物。5預(yù)期發(fā)表SCI論文21-27篇，其中發(fā)表IF>5.0的SCI論文6-11篇。第二年1ABR功能與腦卒中關(guān)系的膽堿能等通路研究；深入進行熱量限制對腦卒中預(yù)防作用的機制研究。研究visfatin的內(nèi)源性保護作用機制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；完善visfatin活性化合物篩選模型；IL-6對自發(fā)性腦卒中的影響；發(fā)現(xiàn)新的脂肪細胞因子。探討ClC-3基因沉默對腦血管重構(gòu)/腦卒中的影響以及bestrophin對腦血管重構(gòu)/腦卒中的作用。明確27bpmiRNA是否由eNOSpre-mRNA剪切產(chǎn)生，并篩選促使斑塊破裂的新基因。2完成1200例腦卒中分型病例和100例對照組受試者的前瞻性入選及DNA提取，完成300例全基因組掃描。完成研究對象分組〔顱內(nèi)動脈狹窄組和顱內(nèi)動脈正常組各300例〕及DNA采取。3應(yīng)用基因敲除鼠，研究KATP通道和AQP4對神經(jīng)-膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)與腦卒中神經(jīng)損傷的相關(guān)性。4經(jīng)尾靜脈給SHR-SP注射AAV1-StAR，提高體內(nèi)原本存在但次要的能將血脂清說明除出體內(nèi)的途徑；給SHR-SP的腦動脈轉(zhuǎn)染AAV1-NDRG2或NOGO-B，檢驗StAR和腦血管新功能基因NDRG2和NOGO-B轉(zhuǎn)基因防治腦卒中的可行性；完善基于高通量篩選的現(xiàn)有化學(xué)生物學(xué)平臺；AQP4阻斷劑、酸敏感通道ASIC1阻斷劑、PAI-1調(diào)節(jié)劑、Kir6.1/SUR1和Kir6.1/SUR2抑制劑高通量篩選。1說明ABR功能預(yù)防腦卒中發(fā)生的膽堿能抗炎通路等機制及其作為預(yù)防靶點的可行性；初步說明熱量限制預(yù)防腦卒中的機制；明確visfatin能否促進腦卒中后新生血管形成和神經(jīng)元再生及其相應(yīng)機制；visfatin活性化合物篩選模型建成；在整體動物上明確IL-6基因敲除是否延緩腦卒中的發(fā)生；發(fā)現(xiàn)新的脂肪細胞因子1-2個；通過整體動物實驗明確Cl-通道對腦血管重構(gòu)/腦卒中的作用，并為基因水平預(yù)防腦卒中提供重要的理論依據(jù)；說明27bpmiRNA產(chǎn)生的分子機制，確定促使斑塊破裂的新基因新通路2初步建立腦卒中分型數(shù)據(jù)庫、血標本庫和基因庫，初步探討不同腦卒中亞型的臨床表現(xiàn)及易感基因；初步發(fā)現(xiàn)高血壓患者發(fā)生顱內(nèi)動脈狹窄的危險因素。3說明KATP通道和AQP4對導(dǎo)致腦卒中神經(jīng)損傷的多元病理機制均具調(diào)制作用，是研發(fā)多潛能神經(jīng)保護劑的重要靶點。4說明AAV1-StAR將血脂清說明除出體內(nèi)的途徑以及StAR、NDRG2和NOGO-B對腦卒中的防治作用；完成200種常用中草藥含16000個組分的建庫工作。完成影響AQP4、PAI-1、ASIC1、Kir6.1/SUR1和Kir6.1/SUR2組分的篩選。進一步獲得高活性單體化合物。5預(yù)期發(fā)表SCI論文24-33篇，其中發(fā)表IF>5.0的SCI論文6-11篇，IF>10.0的SCI論文2篇。第三年1熱量限制預(yù)防腦卒中的sirt1、ABR等機制研究；篩選visfatin天然活性化合物；研究IL-6影響腦卒中發(fā)生的機制研究；新的脂肪細胞因子的功能研究。研究ClC-3基因敲除對腦血管重構(gòu)的影響以及腦血管重構(gòu)及腦卒中發(fā)生過程腦血管平滑肌細胞ROC/SOC功能變化；觀察27bpmiRNA對eNOS表達調(diào)節(jié)的新途徑；觀察參與巨噬細胞活化的關(guān)鍵因子及膠原代謝和高血壓對斑塊破裂的影響。別離鑒定房顫引起血小板活化的蛋白。2完成1200例腦卒中分型病例和100例對照組受試者的前瞻性入選及DNA提取；完成顱內(nèi)動脈狹窄的全基因組關(guān)聯(lián)研究及分析。3應(yīng)用基因敲除鼠建立腦卒中模型，研究A