14、放射生物學(xué)基礎(chǔ)及免疫治療進(jìn)展

放射生物學(xué)及腫瘤免疫學(xué)進(jìn)展廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院袁亞維教授博導(dǎo)主要內(nèi)容放射生物學(xué)電離輻射對(duì)生物體的作用電離輻射的細(xì)胞效應(yīng)分次放射治療的生物學(xué)基礎(chǔ)腫瘤放療中生物劑量等效換算腫瘤免疫治療進(jìn)展放療激活免疫治療的機(jī)制亞臨床證據(jù)結(jié)局的臨床證據(jù)放射生物學(xué)物理階段化學(xué)階段電離輻射作用于生物體直接作用間接作用水分子的電離與激發(fā)擴(kuò)散自由基生物效應(yīng)突變輻射晚期損傷生物分子的電離與激發(fā)修復(fù)化學(xué)鍵斷裂并形成DNA殘基細(xì)胞死亡DNA損傷生物階段1.電離輻射對(duì)生物體的作用2.電離輻射的細(xì)胞效應(yīng)輻射誘導(dǎo)的DNA損傷及修復(fù)輻射所致的細(xì)胞死亡細(xì)胞存活曲線細(xì)胞周期時(shí)相與放射敏感性放射線對(duì)DNA的損傷

輻射所致DNA損傷主要是DNA鏈的斷裂DNA損傷是射線殺滅細(xì)胞和導(dǎo)致細(xì)胞突變的關(guān)鍵。DNA修復(fù)意義維持DNA序列的保真性；通過多種修復(fù)機(jī)制來糾正DNA損傷；DNA修復(fù)失敗可能導(dǎo)致基因突變、疾病和腫瘤。輻射所致的細(xì)胞死亡染色體DNA是輻射引起細(xì)胞死亡的主要靶點(diǎn)細(xì)胞經(jīng)過電離輻射后大多數(shù)死亡，也有少部分細(xì)胞存活，用什么來反應(yīng)電離輻射后的細(xì)胞存活

情況呢？細(xì)胞存活曲線

細(xì)胞放射存活曲線

（cellsurvivalcurves）

描述放射線照射劑量和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系，用以評(píng)估電離輻射對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖能力即再繁殖完整性的影響。

鑒別細(xì)胞存活的唯一標(biāo)準(zhǔn)：受照射后細(xì)胞是否保留無(wú)限增殖的能力，即是否具有再繁殖完整性。

離體細(xì)胞存活曲線的實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)—胰酶消化—含血清培養(yǎng)液—單細(xì)胞懸液測(cè)定克隆形成率：細(xì)胞計(jì)數(shù)—稀釋接種—培養(yǎng)2周—結(jié)晶紫染色、計(jì)數(shù)（>50個(gè)細(xì)胞的克?。y(cè)定存活分?jǐn)?shù)：接種后照射—培養(yǎng)2周—染色計(jì)數(shù)（同上）存活分?jǐn)?shù)計(jì)算公式克隆形成率PE＝細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)細(xì)胞存活率SF(survivingfraction)＝受照射細(xì)胞的克隆形成率/對(duì)照組細(xì)胞的克隆形成率以不同的劑量照射細(xì)胞，得到各劑量組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，以劑量為橫坐標(biāo)，存活分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，用適宜的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行曲線擬合，可得到在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系上的細(xì)胞存活曲線。X射線細(xì)胞存活曲線細(xì)胞周期時(shí)相與放射敏感性

細(xì)胞周期中不同時(shí)相細(xì)胞放射敏感性變化的主要特征可概括為：有絲分裂期（M期）或接近有絲分裂期（G2）的細(xì)胞是放射最敏感的細(xì)胞；晚S期（DNA合成期）通常具有較大的放射抗拒性；對(duì)于G1期細(xì)胞，早期表現(xiàn)相對(duì)輻射抗拒，其后逐漸敏感，G1末期相對(duì)更敏感。3.分次放療的生物學(xué)因素臨床醫(yī)生在設(shè)計(jì)分次治療方案時(shí)，應(yīng)注意把握兩個(gè)要點(diǎn)，即生物學(xué)的合理性和處方劑量設(shè)定的科學(xué)性。影響分次放射治療的生物學(xué)因素主要包括以下“4Rs”概念，即：細(xì)胞放射損傷的修復(fù)（Repair）；周期內(nèi)細(xì)胞的再分布（Redistribution）；氧效應(yīng)及乏氧細(xì)胞的再氧合（Reoxygenation）；再群體化（Repopulation）。輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞放射損傷類型致死損傷(lethaldamage,LD)：受照射后細(xì)胞完全喪失了分裂增殖能力，是一種不可修復(fù)的，不可逆的和不能彌補(bǔ)的損傷。亞致死損傷(sublethaldamage,SLD)：受照射后細(xì)胞的部分靶而不是所有靶內(nèi)所累積的電離事件，通常指DNA的單鍵斷裂。是一種可修復(fù)的放射損傷，對(duì)細(xì)胞死亡影響不大。潛在致死損傷(potentialdamage,PLD)：正常狀態(tài)下應(yīng)當(dāng)在照射后死亡的細(xì)胞，若在照射后置于適當(dāng)條件下，由于損傷的修復(fù)又可存活的現(xiàn)象。但若得不到適宜的環(huán)境和條件則轉(zhuǎn)化為不可逆的損傷，使細(xì)胞最終喪失分裂能力。亞致死損傷的修復(fù)亞致死損傷的修復(fù)是指，假如將某一即定單次照射劑量分成間隔一定時(shí)間的兩次時(shí)，所觀察到的存活細(xì)胞增加的現(xiàn)象單次照射15.58Gy的存活分?jǐn)?shù)是0.005，如果把這個(gè)劑量分成相等的2次，間隔30分鐘，細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)要比單次照射明顯高一些，隨著間隔時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)會(huì)繼續(xù)增高，而在2小時(shí)左右達(dá)到平臺(tái)。防止細(xì)胞在這段時(shí)間內(nèi)發(fā)生細(xì)胞周期的移動(dòng)。亞致死損傷的修復(fù)亞致死損傷的修復(fù)影響因素：放射性的性質(zhì)：高LET射線照射后細(xì)胞沒有亞致死損傷，因此不存在亞致死損傷的修復(fù)。細(xì)胞的氧合狀態(tài)：處于慢性乏氧環(huán)境的細(xì)胞比氧合狀態(tài)好的細(xì)胞對(duì)亞致死損傷的修復(fù)能力差。細(xì)胞群的增殖狀態(tài)：未增殖的細(xì)胞幾乎沒有亞致死損傷的修復(fù)。PS：臨床非常規(guī)分割照射過程中，兩次照射之間間隔時(shí)間應(yīng)大于6小時(shí)，以利于亞致死損傷完全修復(fù)。周期內(nèi)細(xì)胞的再分布分次照射期間，處于細(xì)胞周期相對(duì)放射抗拒時(shí)相的腫瘤細(xì)胞向放射敏感時(shí)相移動(dòng)。氧固定假說在有氧的條件下，氧與自由基R?作用形成有機(jī)過氧基（RO2?），并最終在靶分子上形成ROOH，它是靶物質(zhì)的不可逆形式，于是損傷被化學(xué)固定下來，稱為氧“固定”作用。照射后即刻的乏氧分?jǐn)?shù)將會(huì)接近100%，然后逐漸下降接近初始值，這種現(xiàn)象稱為再氧合。乏氧細(xì)胞的再氧合足氧細(xì)胞15％乏氧細(xì)胞Ray100％乏氧細(xì)胞15％乏氧細(xì)胞再氧合乏氧細(xì)胞的再氧合圖中說明了大劑量分次照射氧合好的細(xì)胞和乏氧細(xì)胞的效應(yīng)。假如沒有再氧合發(fā)生，則每分次劑量照射后只能期望殺死極小比例的乏氧細(xì)胞，乏氧細(xì)胞的存活曲線較氧合好的細(xì)胞存活曲線平坦。在療程后期，乏氧細(xì)胞群體的效應(yīng)將占重要地位，分次照射有利于乏氧細(xì)胞的再氧合，因此可采用分次放射治療的方法使其不斷氧合并逐步殺滅。再群體化再群體化（正常組織）：損傷之后，組織的干細(xì)胞在機(jī)體調(diào)節(jié)機(jī)制的作用下，增殖、分化、恢復(fù)組織原來形態(tài)的過程稱做再群體化。加速再群體化（腫瘤組織）：照射或使用細(xì)胞毒性藥物后可啟動(dòng)腫瘤內(nèi)存活的克隆源細(xì)胞，使之比照射或用藥以前分裂更快。放射治療期間存活的克隆源性細(xì)胞的再群體化是造成早反應(yīng)組織、晚反應(yīng)組織及腫瘤之間效應(yīng)差別的重要因素之一。大部分早反應(yīng)組織有一定程度的快速再群體化，而晚反應(yīng)組織由于它的生物學(xué)特性一般認(rèn)為療程中不發(fā)生再群體化。如果療程太長(zhǎng)，療程后期的分次劑量效應(yīng)將由于腫瘤內(nèi)存活干細(xì)胞已被啟動(dòng)進(jìn)入快速再群體化而受到影響。再群體化的意義4.腫瘤放療中生物劑量等效換算生物劑量：指生物體對(duì)輻射反應(yīng)程度的測(cè)量“生物劑量”與“物理劑量”是不同的概念通過換算數(shù)學(xué)模型進(jìn)行不同放療計(jì)劃比較在放療計(jì)劃中有三個(gè)因素應(yīng)經(jīng)常被注意的：當(dāng)改變常規(guī)治療計(jì)劃時(shí)應(yīng)計(jì)算保持相等生物效應(yīng)所需要的總劑量；爭(zhēng)取一個(gè)合理的分次方案；比較不同分次劑量、分次數(shù)、總治療時(shí)間的治療技術(shù)。生物劑量的概念

線性二次模型LQ模型（linear-quadraticmodel）

(DNA雙鏈斷裂模型)

SF=exp(-αD-βD2)orE=αD+βD2

SF存活分?jǐn)?shù)

e自然對(duì)數(shù)

D分次照射的劑量αβ

系數(shù)

E組織效應(yīng)水平上述公式表明，某一劑量造成的細(xì)胞殺傷可由直接致死效應(yīng)和間接致死效應(yīng)組成，即α型和β型細(xì)胞殺傷。當(dāng)單次照射引起上述兩種效應(yīng)相等時(shí)，α/β值即為兩種效應(yīng)相等時(shí)的劑量。即αD=βD2時(shí)α/β=Dα/β比值反映了不同組織分次照射敏感性的差異。線性二次模型正常早反應(yīng)組織：α/β值較高（約為10），表明直接殺傷相對(duì)明顯，損傷后以活躍增殖來促使損傷修復(fù)，對(duì)治療時(shí)間敏感。正常晚反應(yīng)組織：α/β值較低（約為3），表明直接殺傷要比早反應(yīng)組織少，可修復(fù)損傷累積引起的殺傷較多，對(duì)分割劑量敏感。線性二次模型生物效應(yīng)劑量E（組織效應(yīng)水平）=αD+βD2E/α=D+(β/α)D2E/α被稱作生物效應(yīng)劑量生物效應(yīng)劑量（biologicaleffectivedose,BED）是指分次數(shù)無(wú)窮多，分次劑量無(wú)窮小時(shí)產(chǎn)生相等生物效應(yīng)所需的理論總劑量，單位為Gy。若分次劑量為d，采用分隔時(shí)間大于6小時(shí)的分割照射，分次數(shù)為n，且允許亞致死損傷獲得完全修復(fù)，BED公式可改寫為：BED=nd×[1+d/(α

/β)]患者男性，診斷單個(gè)肺轉(zhuǎn)移瘤，放療方案8Gy/F×5F，相當(dāng)于常規(guī)分割（2Gy/F）劑量下要進(jìn)行多少次放療？設(shè)：腫瘤的α/β=10GyBED=nd×[1+d/(α

/β)]計(jì)算結(jié)果：30次BED公式應(yīng)用患者男性,45歲,診斷中央型肺癌，上腔靜脈壓迫綜合癥(SVCS),擬定放療計(jì)劃60Gy/30F，為緩解SVCS，先給3Gy/F×5F，其后繼續(xù)2Gy/F。Q:保持與2Gy/F相等晚期反應(yīng)后續(xù)應(yīng)給多少次？設(shè)：肺纖維化α/β=3GyBED=nd×[1+d/(α

/β)]計(jì)算結(jié)果：21FBED公式應(yīng)用腫瘤免疫治療進(jìn)展為什么腫瘤免疫治療如此轟動(dòng)？Science年度十大科學(xué)突破，癌癥免疫療法登榜首免疫治療顯著延長(zhǎng)晚期腫瘤患者生存時(shí)間化療和小分子靶向治療-控制癥狀，提高生活質(zhì)量-生存曲線無(wú)明顯“拖尾現(xiàn)象”免疫治療-生存曲線“拖尾現(xiàn)象”證據(jù)（1）

PD-1抗體Nivolumab二線治療轉(zhuǎn)移性肺鱗癌(CheckMate017)

1年生存率42%，2年生存率30%BrahmerJ.NEnglJMed.2015;373(2):123-35.證據(jù)（2）

PD-1抗體Keytruda二線治療NSCLC

（Keynote-010,鱗癌和腺癌各1/2）

全體患者PD-L1>50%患者

GaronEB.Lancet2016;387:1540–50腫瘤免疫治療的變遷年代治療原則治療策略轉(zhuǎn)移性腫瘤受益安全性2000年之前非特異性活化免疫系統(tǒng)，或建立抗原特異性免疫應(yīng)答驅(qū)動(dòng)免疫應(yīng)答IL-2、IFN、疫苗、LAK/IL-2、TIL/IL-2、CIK、NK、?δT黑色素瘤腎癌≯20%良好2000年之后1.建立抗原特異性免疫應(yīng)答2.誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤組織3.解除免疫抑制，使淋巴細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中保持細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答型腫瘤：免疫剎車1.免疫檢查點(diǎn)抑制劑2.免疫刪除+TIL/多克隆CTL/IL-23.免疫刪除+疫苗免疫應(yīng)答缺乏型腫瘤：模擬免疫殺傷1.免疫刪除+TCT-T/CAR-T2.抗體-藥物偶合物3.多功能抗體廣譜20%-80%毒性與療效如影隨形FDA批準(zhǔn)上市的免疫治療藥物(2016.5)分類藥物適應(yīng)癥細(xì)胞因子白介素2/干擾素/胸腺肽黑色素瘤、腎癌治療性腫瘤疫苗Provenge(2010)前列腺癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑CTLA-4抗體：Ipilimumab(2011)黑色素瘤PD-1抗體：Pembrolizumab（2014）Nivolumab(2014)黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌PD-L1抗體Atezolizumab（2016.5）膀胱癌抗體-藥物偶合物TrastuzumabEmtansine(2013)Her2(+)乳腺癌BrentuximabVedotin(2011)CD30+淋巴瘤

多功能抗體和改型抗體Cetumaxomab(2009,歐盟)EpCAM（+）癌性腹水Blinatumomab(2014)CD19（+）白血病Elotuzumab(2015)CS1（+）多發(fā)性骨髓瘤Daratumumab（2015）CD38(+)多發(fā)性骨髓瘤溶瘤病毒T-vec（2015.10）黑色素瘤上市的免疫檢查點(diǎn)蛋白特異性抗體靶點(diǎn)藥物適應(yīng)癥上市時(shí)間伴隨診斷CTLA-4Ipilimumab(Yervoy)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤2011.3III期皮膚黑色素瘤輔助治療2015.11PD-1Nivolumab（Opdivo）轉(zhuǎn)移性黑色素瘤2014.7（二線）2015.10（一線，BRAF野生型）轉(zhuǎn)移性腎癌2015.11（二線）轉(zhuǎn)移性肺鱗癌2015.3（二線）轉(zhuǎn)移性非鱗非小細(xì)胞肺癌2015.10（二線）PD-L1IHC28-8pharmDxtest

Pembrolizumab（Keytruda)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤2014.9（二線）轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌2015.10（二線）PD-L1IHC22C3pharmDxtestCTLA4+PD-1Nivo+ipi轉(zhuǎn)移性黑色素瘤2015.9（一線）PD-L1Atezolizumab（Tecentriq）轉(zhuǎn)移性膀胱癌2016.5（二線）如何才能觸發(fā)免疫應(yīng)答？StimulatoryandInhibitoryFactors

intheCancer-ImmunityCycleCytotoxicTlymphocyteassociatedantigen4(CTLA4)靜止?fàn)顟B(tài)：CTLA-4存在于T細(xì)胞的胞漿中majorhistocompatibilitycomplextumour-associatedantigensTcellreceptor活化狀態(tài)：表達(dá)于細(xì)胞表面，阻止CD28與APC表面B7的結(jié)合，抑制T細(xì)胞的增殖負(fù)向共刺激分子B7活化信號(hào)通路

第二信號(hào)通路有兩種受體存在于T細(xì)胞表面B7CD28低親和力受體

CTLA-4高親和力受體B7傳遞陽(yáng)性或陰性信號(hào)決定于T細(xì)胞上的配基B7-CD28結(jié)合：產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，阻斷CTLA-4。B7-CTLA-4結(jié)合：封閉CD28依賴的T細(xì)胞激活，

產(chǎn)生陰性信號(hào)，下調(diào)免疫反應(yīng)。

PD-1inT-cellactivation,exhaustion,andeffectorfunctionB7分為：B7-1（又名為CD80）和B7-2（又名為CD86）如何提高腫瘤免疫應(yīng)答？如何設(shè)計(jì)免疫治療方案？免疫治療聯(lián)合放射治療1.放療激活免疫反應(yīng)的機(jī)制直接殺死靶區(qū)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞釋放出大量及多樣性的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)釋放危險(xiǎn)信號(hào)輻射誘導(dǎo)損傷相關(guān)模式分子（DAMPs）細(xì)胞因子的表達(dá)IL-2、IL1a、IL1b、IL12、GM-CSF，促進(jìn)APCs、T細(xì)胞的活化和增殖放療所致腫瘤支持間質(zhì)的破壞增強(qiáng)免疫識(shí)別腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，有利于效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤內(nèi)部與腫瘤細(xì)胞直接接觸腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、髓源性抑制性細(xì)胞（MDSCs），解除間質(zhì)細(xì)胞的對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的免疫抑制活性血管內(nèi)皮細(xì)胞。異常血管結(jié)構(gòu)正常化，改善氧合狀態(tài)，有利于淋巴細(xì)胞、藥物進(jìn)入腫瘤組織。免疫調(diào)制抗凋亡和/或促存活基因的下調(diào)抗原加工處理相關(guān)蛋白的表達(dá)鈣網(wǎng)蛋白轉(zhuǎn)位到腫瘤的細(xì)胞表面，與一些固有免疫細(xì)胞表面的受體CD91/lRP1結(jié)合，如巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)這些細(xì)胞的免疫應(yīng)答

Friedman,

E.

J.,Curr.Pharm.Des.,2002Friedman,

E.

J.,Curr.Pharm.Des.,20022.亞臨床證據(jù)1）SABR不同分割模式對(duì)免疫系統(tǒng)激活的影響有效的免疫刺激在7.5-10Gy，使用更高劑量的照射，即>15Gy，卻增加了脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的比例。這些數(shù)據(jù)表明SABR對(duì)免疫系統(tǒng)的激活存在一個(gè)閾劑量，低于這個(gè)劑量免疫刺激可能不是最理想的，高于這個(gè)劑量免疫抑制可能占優(yōu)勢(shì)。

Aryankalayil,

M.

J.Radiat.Res.2014Fractionatedradiationaffectstumorcontrol,tumor-specificIFNγ+splenocytesandalterssplenicTregs.MicebearingB16-OVAtumorsof4mminsizeweregivenfractionatedradiationin6hintervalsofatotaldoseof15Gyandleftfor7daystorecover.Schaue,

D.,Int.J.

Radi.Oncol.Biol.Phys,2012InflectionpointkineticsofimmunegenesinmultifractionatedtreatedPC3andDU145cellsasassessedbyreal-timeRT-PCR.PC3andDU145cellswereexposedto1–10Gyofradiationdeliveredas1Gymultifractionatedtreatment.

Aryankalayil,

M.

J.Radiat.Res.2014RadiationinducesproinflammatoryDAMPsandpositivelymodulatesthecytokineenvironment.Prostatecarcinomacells(DU145,PC3,LNCaP)wereexposedto10Gyfractionatedtreatment(1Gy×10,multifractionated,graybars)or10Gysingle-dosetreatment(10Gy,singledose,blackbars)orweremockirradiated(0Gy,openbars).Aryankalayil,

M.

J.Radiat.Res.2014在進(jìn)行至少10Gy照射處理之后，共刺激和共抑制T細(xì)胞信號(hào)分子可能被調(diào)節(jié)，以促進(jìn)多效抗腫瘤免疫反應(yīng)。Bernstein,

M.

B.CancerBiother.Radiopharm.2014IrradiatedPCacellsmodulatethebalanceofpositiveandnegativecostimulatorymolecules(B)DU145cellswereirradiatedwith10Gyorleftuntreated(0Gy).Numbersindicatepercent-positivecells,andeachmoleculeisgraphedonanindependentscale.(C)PC3cells,(D)LNCaPcells,and(E)PrECs.*Statisticalsignificancerelativetountreatedcells.PCa,prostatecancer;PrECs,prostateepithelialcells.Bernstein,

M.

B.CancerBiother.Radiopharm.2014IrradiatedPCacellsmodulatethebalanceofpositiveandnegativecostimulatorymoleculesinadose-dependentmanner.(A)DU145