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文檔簡介
核酸的生物合成()第1頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
1、基因——DNA大分子上的各個功能片段,有復制、轉(zhuǎn)錄等功能。
2、分子生物學中心法則及其補充。DNA
RNA
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯復制反轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)復制第2頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
3、基因表達——通過轉(zhuǎn)錄和翻譯、用基因的遺傳信息在細胞內(nèi)合成有功能意義的各種蛋白質(zhì)。由于中心法則的建立,人們對核酸、蛋白質(zhì)的研究更深入了,不僅研究它們的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用以及它們之間一套復雜、精確的調(diào)控機制、調(diào)控基因的表達與不表達;而且在體外可對DNA進行改造,使遺傳性狀改變或有目的地使基因表達產(chǎn)生蛋白質(zhì)等基因工程的應(yīng)用?,F(xiàn)今,人們把研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能以及它們之間相互作用的科學劃分為又一門新的學科,即分子生物學。第3頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五隨著分子生物學的進一步研究,將來對中心法則可能還會作出進一步補充。如RNA在中心法則中只是參與遺傳信息的表達,但在補充法則卻作為遺傳物質(zhì);最近發(fā)現(xiàn)某些RNA分子具有酶活性。最近,有學者提出:RNA不單是溝通“DNA—蛋白質(zhì)”之間的橋梁。RNA可能是功能比DNA更廣泛的信息分子、可能是生命起源過程中最早出現(xiàn)的生物大分子。第4頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五本篇依中心法則將介紹復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。同時介紹基因調(diào)控和基因工程這兩個在生命科學中處于理論和應(yīng)用的最前沿課程。第5頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
一、DNA復制方式1、DNA復制模式—半保留復制(1)復制——以親代DNA為模板,以四種dNTP
為原料,按堿基配對原則(A=T,G≡C)
合成子代DNA的過程。(2)DNA復制的特點之一:半保留復制第一節(jié)DNA的生物合成第6頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五半保留復制——DNA復制時,親代DNA的兩條鏈都作為模板,各自指導合成互補鏈,形成兩個與親代DNA完全一樣的子代分子,在每個子代DNA分子中均保留了一條親代DNA鏈,DNA這種復制方式被稱為半保留復制。第7頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第8頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第9頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五2、半不連續(xù)復制(1)岡崎片段和半不連續(xù)復制由于DNA雙鏈走向相反,而復制方向為5′→3′,模板方向一定為3′→5′,故必有一股新鏈其模板解鏈方向與復制方向一致,可以連續(xù)合成,稱為前導鏈;而另一股鏈其復制方向與解鏈方向相反,不能連續(xù)合成,稱為滯后鏈(或后隨鏈)。不連續(xù)合成的后隨鏈的一個個片段稱為岡崎片段。后隨鏈的復制是由引物酶分段生成RNA引物,然后在各段引物的基礎(chǔ)上分段延長的。第10頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第11頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五原核生物——總是從一個固定的起始點開始,在兩條模板上同時向兩個(相反)方向進行,稱雙向復制。真核生物——①雙向復制;②多點復制(有多個復制起始點,同時形成多個復制單位)。單向復制模式和雙向復制模式復制泡二、復制點(DNA復制的起始點和方向)第12頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五三、DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶及相關(guān)蛋白因子1)引發(fā)酶作用——在模板的復制起始部位催化互補堿基的聚合,形成短片段RNA引物。其本質(zhì)為:RNA聚合酶(是一種不同于DDRP的RNA聚合酶)。2)引發(fā)體——為解鏈酶與其他復制因子結(jié)合辨認起始點時再結(jié)合引物酶形成引發(fā)體。[引發(fā)體≈解鏈酶+其它復制因子+引發(fā)酶]故引發(fā)體的作用是:辯認起始點,結(jié)合在DNA模板上,解開DNA雙鏈,催化RNA引物形成。3)引物為什么是RNA而不是DNA——依賴于DNA模板的DNA聚合酶簡稱DDDP,不能催化兩個游離的dNTP聚合,而RNA聚合酶能催化兩個游離的NTP聚合。1、RNA引物合成酶(引發(fā)酶)第13頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五2、DNA聚合酶催化5′→3′的聚合反應(yīng):在引物上3′-OH未端逐個加入dNMP(由dNTP去除PPi生成),使新鏈不斷延長。反應(yīng)需:
①模板,按A=T,G≡C合成新鏈。②引物,引物3′-OH和下一個dNMP在聚合酶催化下生成3′,5′-磷酸二酯鍵,通過3′,5′-磷酸二酯鍵將單個核苷酸連成長鏈。
③合成方向5′→3′,模板閱讀方向3′→5′。第14頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五3、DNA連接酶1〉作用:連接DNA鏈3′-OH未端和另一DNA鏈的5′-P未端,使二者生成磷酸二酯鍵。如連接岡崎片段,DNA修復、重組、剪接中起缺口縫合等。2〉注意:連接酶連接的都是堿基互補基礎(chǔ)上的雙鏈中的單鏈缺口,不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈作用。第15頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五4、解旋、解鏈酶類解開“超螺旋”,解開并理順模板DNA雙鏈,與SSB配合維持(模板部位)單鏈狀態(tài)?!锝怄溍福鹤饔茫航忾_DNA雙鏈。解鏈酶有兩種,一是
rep蛋白(解鏈酶I),沿模板3′→5′
移動。二是解鏈酶II,沿模板5′→3′移動。第16頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五5、單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNA-bindingProtein,SSB或DBP),曾稱螺旋反穩(wěn)定蛋白(HDP)作用:
①與解開的單鏈DNA結(jié)合,維持復制時模板處于單鏈狀態(tài),防止復性。②對抗核酸酶水解單鏈DNA,保護單鏈完整性。
SSB可結(jié)合跨度為32個核苷酸單位,在DNA
解鏈中不斷結(jié)合,脫離再結(jié)合。第17頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五6、DNA拓撲異構(gòu)酶(拓撲酶)作用:松馳超螺旋,克服解鏈中出現(xiàn)的打結(jié)纏繞、連環(huán)現(xiàn)象。拓撲酶廣泛存在于真核細胞及原核細胞,可分為兩型:
〈1〉I型拓撲酶:切斷雙鏈DNA中的一段,待DNA松弛后可將切口接上。不需ATP。
〈2〉II型拓撲酶:有雙重作用水解作用——切斷雙鏈DNA某部位,松弛超螺旋。(不需ATP)接合作用——DNA松弛解纏后,連接斷口,并使
DNA進入負螺旋狀態(tài)(右旋;“負”比“正”有更好的模板作用)。(消耗ATP)第18頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五DNA的復制過程1、起始1)辯認起始部位:由解鏈酶在DnaB起始蛋白協(xié)助下結(jié)合于復制起始點上。2)解開DNA雙鏈:在起始點進行,解鏈酶解開DNA雙鏈。需ATP(2ATP/bp)。3)拓撲酶(主要為II型)松解超螺旋,防止由于解鏈出現(xiàn)的下游打結(jié)及纏繞現(xiàn)象。第19頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五4)SSB(單鏈DNA結(jié)合蛋白)結(jié)合于開放的單鏈上,穩(wěn)定和保護單鏈作用5)引發(fā)體中的引發(fā)酶按堿基配對規(guī)律合成RNA引物。(以DNA為模板按5′→3′方向合成。引物約含十幾~幾十個堿基、有3′-OH未端的RNA片段)。6)polIII的亞單位辯認引物。第一個脫氧核苷酸在該酶催化下加到引物3-OH未端上,形成磷酸二酯鍵。第20頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第21頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五復制叉形成
復制叉——無論原核或真核細胞,復制開始由于DNA雙鏈解開,在兩股單鏈上同時進行復制,在電鏡下均看到伸展成叉狀的復制現(xiàn)象。在引物生成后,復制叉的形狀已基本具備。復制的速度:細菌復制速度很快,2500bp/s,20分鐘可繁殖一代。真核生物復制速度慢些,但因其有多個復制始點,故總速度與原核差不多。第22頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第23頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五2、復制的延長
由DNA聚合酶(原核polIII;真核DNA聚合酶)催化dNTP以DNA為模板,按堿基配對原則逐個加到新鏈中,鏈得以延長,新鏈合成方向5′→3′。第24頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五復制的速度:細菌復制速度很快,2500bp/s,20分鐘可繁殖一代。真核生物復制速度慢些,但因其有多個復制始點,故總速度與原核差不多。第25頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五Eukaryotic真核生物DNAreplicationProkaryote原核生物DNAreplication第26頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五(2)前導鏈和滯后鏈的合成
DNA雙鏈走向相反,模板方向為3′→5′,而復制方向5′→3′。
1)前導鏈:一股新鏈其模板解鏈方向與復制方向一致,可以連續(xù)合成,稱為Leadingstrand前導鏈;2)滯后鏈:另一股鏈其復制方向與解鏈方向相反,不能連續(xù)合成,稱為Laggingstrand滯后鏈。第27頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五3、復制的終止1)引物水解。由一種RNase將領(lǐng)頭鏈及岡崎片段的引物水解除去。2)修補空缺(引物水解后留下的空缺)。
①由DNA聚合酶催化(原核polI;真核DNA聚合酶β);②修補方向也是5′→3′。3)連接。由DNA連接酶催化。①連接岡崎片段;②連接領(lǐng)頭鏈的主體與引物空缺修補小片段。第28頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五1、原核細胞DNA的復制(1)復制所需的條件(或稱“復制體系”):1)底物:dNTP2)聚合酶:DNA聚合酶3)模板:模板DNA的雙鏈(即解開為單鏈狀態(tài)的兩條DNA母鏈)4)引物:DNA聚合酶不能催化兩個游離的dNTP互相聚合,需一引物。引物即為小分子RNA(含3′-OH的寡核苷酸)。5)其他酶和蛋白質(zhì)因子。如解旋酶、解鏈酶、DNA
連接酶等。三、原核生物中DNA的復制第29頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五(2)原核生物的DNA聚合酶為三種:
polIpolIIpolIII
含量最多最少活性見課本見課本見課本功用校讀、修復復制復制最主要的酶填補空缺核酸外切酶活性5′→3′+—+3′→5′+++第30頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五※核酸外切酶活性。
〈1〉5′→3′外切酶活性:從5′端把核苷酸從核酸鏈上水解下來,polI、III具有。
〈2〉3′→5′外切酶活性:從3′端把核苷酸從核酸鏈上水解下來,polI、II、III
均具有。第31頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
※核酸外切酶活性的作用是:
①即時校讀——DNA復制出現(xiàn)堿基配對錯誤時,DNA聚合酶利用外切酶活性(主要為3′→5′外切酶)清除錯配堿基,并利用5′→3′聚合酶活性補回正確配對堿基,這種功能稱之。主要由polI完成。
②切除引物、切除突變的片段——均為polI5′→3′外切酶的作用。第32頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五※復制的保真性(fidelity)
1、概念——DNA復制時DNA聚合酶依賴模板,保證遺傳信息傳代延續(xù)中子鏈與母鏈配對準確無誤,稱之。
2、保真機理
〈1〉遵守嚴格的堿基配對規(guī)律。聚合時,磷酸二酯鍵的形成應(yīng)在氫鍵的準確搭配之后發(fā)生。
〈2〉聚合酶在復制延長中對堿基的選擇功能。如母鏈為T,酶能選擇A而不是其他。
〈3〉復制中出錯時有即時校讀功能(有錯即改)。第33頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第34頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五原核生物DNA的復制過程:辯認起始部位:由解鏈酶在識別蛋白協(xié)助下結(jié)合于復制起始點上。解開DNA雙鏈:在起始點進行。解鏈酶解開DNA雙鏈。需ATP解開雙鏈并非解鏈酶單獨作用(2ATP/bp),可能構(gòu)成引發(fā)體后再進行解鏈。
DNA旋轉(zhuǎn)酶或拓撲酶(主要為II型)松解超螺旋,防止由于解鏈出現(xiàn)的下游打結(jié)及纏繞現(xiàn)象。第35頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五單鏈結(jié)合蛋白SSB結(jié)合于開放的單鏈上,穩(wěn)定和保護單鏈作用引發(fā)體中的引發(fā)酶按堿基配對規(guī)律合成RNA引物。[以DNA為模板按5′→3′方向合成。引物約含十幾~幾十個堿基、有3′-OH未端]。polIII的亞單位辯認引物。第一個脫氧核苷酸在該酶催化下加到引物3-OH未端上,形成磷酸二酯鍵。第36頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第37頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五四、真核生物中的DNA復制真核生物的DNA聚合酶為五種:1)DNA聚合酶αandδ主要復制
染色體DNA,DNA聚合酶α主要為滯后鏈的合成;DNA聚合酶δ主要為前導鏈的合成2)DNA聚合酶βandε主要為修復DNA,3)DNA聚合酶γ主要線粒體DNA復制和修復.第38頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五★端粒與端粒酶端粒:是真核細胞染色體末端一種膨大的、DNA富含GC重復序列的粒體結(jié)構(gòu)。端粒酶:是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的能催化DNA合成的酶。這種合成以本身的RNA為模板。模板AGGGTTAC新鏈5’CCCAAUG(RNA片斷)端粒酶端粒DNApolymerase第39頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五3)在真核細胞,DNA復制的同時,各種染色體蛋白(組蛋白及非組蛋白)同時合成。一但DNA復制結(jié)束,即可裝配為核蛋白并組成染色體。第40頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五五、反轉(zhuǎn)錄作用(RNA指導的DNA合成)DNARNA轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄主要從病毒中發(fā)現(xiàn)RNA指導的DNA聚合酶、其催化底物為dNTP,催化生成與RNA(作為模板)堿基序列互補的DNA;遺傳信息從RNA流向DNA。第41頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五〈一〉DNA突變突變的概念:由于理化因素使DNA組成改變,即DNA分子上的堿基改變,如未能完全修復而引起可遺傳的變異稱之。又稱基因突變。突變的原因有:自發(fā)突變和誘變:自發(fā)突變即遺傳過程“自發(fā)”地發(fā)生;誘變即用人工手段(理化因素:如紫外線、離子輻射、羥胺、亞硝酸鹽、氮芥類等。),使DNA發(fā)生突變。第二節(jié)DNA的損傷與修復第42頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第43頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五(二〉突變的結(jié)果包括:
①致死性;②生物體內(nèi)某些功能喪失;
③只改變基因而對表現(xiàn)型無影響;
④產(chǎn)生了利于物種生存或有利于人類的結(jié)果。第44頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五〈三〉突變的類型:1、點突變:DNA分子上一個堿基的變異。又分為轉(zhuǎn)換和顛換:轉(zhuǎn)換即同型堿基的轉(zhuǎn)換;顛換即異型堿基(嘌呤與嘧啶)的轉(zhuǎn)換。2、缺失:一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA上消失。3、插入:一個堿基或一段核苷酸鏈插入到另一個DNA
分子上,缺失和插入均引起移碼突變(轉(zhuǎn)錄后密碼子改變)。4、倒位:DNA鏈內(nèi)部重組。其中一段方向反置,如從5′→3′變?yōu)?′→5′或一大段DNA分子在DNA分子內(nèi)遷移。第45頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五GAAGTAGCTGAGGTAGCT為點轉(zhuǎn)換突變GACCTAGCTGACTTAGCT為為點顛換突變GACGTAGCTGATAGCT為為缺失突變GACGTAGCTGACGCATAGCT為插入突變GACGTAGCTGACGATGCT為倒位突變第46頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五復制過程中發(fā)生DNA突變稱為DNA損傷,大多屬于自發(fā)突變。體內(nèi)靠校讀和修復機制消除已發(fā)生的缺陷。1、校讀:核內(nèi)polI有核酸外切酶活性,隨時把錯誤配對的核苷酸切除,并利用其DNA聚合酶活性補回正確的核苷酸。這種由polI監(jiān)視和糾正復制錯誤的功能稱校讀。二、損傷的修復第47頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五2、修復:如錯誤配對屢屢發(fā)生或涉及范圍大,則需一些機制來修復,包括:(1)、光修復:需光能激活的修復酶修復。如該酶可使因紫外線照射而形成的二聚體TT分解為原來的單體狀態(tài)。(2)、切除修復:需特異核酸內(nèi)切酶、polI、DNA連接酶的共同作用。這是人類DNA損傷的主要修復方式。第48頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第49頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第50頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第51頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五3、重組修復:適于損傷面積較大時。4、SOS修復:緊急修復,出現(xiàn)的錯誤多且廣泛。由于修復不完全,可引起較長期廣泛的突變。第52頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第53頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五轉(zhuǎn)錄(DNA指導下的RNA合成)1、轉(zhuǎn)錄—生物體以DNA為模板,按堿基互補規(guī)律合成RNA的過程。把DNA的堿基序列抄錄成RNA的堿基序列。2、轉(zhuǎn)錄所需的條件:
〈1〉原料:NTP〈2〉模板:DNA雙鏈中的一股
〈3〉酶:RNA聚合酶,全稱為“依賴DNA的RNA聚合酶”(DNA-dependentRNApolymeraseDDRP),也稱轉(zhuǎn)錄酶。第三節(jié)RNA的生物合成一、概述第54頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五〈一〉原核生物的RNA聚合酶(以E.coli的酶研究比較透徹)
1、該酶由5個亞基組成:即α2ββ′б,其中б亞基易脫落。
2、核心酶:即α2ββ′,具有催化聚合功能,不能辯認起始點,但參與轉(zhuǎn)錄的延長。一、RNA聚合酶第55頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
3、全酶;即α2ββ′б,既辯認轉(zhuǎn)錄起始點,又有催化聚合功能,參與轉(zhuǎn)錄起始。
4、各亞基的功能:
α亞基——決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄
β亞基——與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān)
β′亞基——結(jié)合DNA模板
б亞基——辯認起始點。σ亞基本身并無催化功能;它的作用是識別DNA分子上的起始信號。
第56頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五有三種類型:RNApolI、RNApolII、RNApolIII。
RNApolI轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為rRNA的前體(45S-rRNA);
RNApolII轉(zhuǎn)錄mRNAD的前體(hnRNA);
RNApolIII轉(zhuǎn)錄5S-rRNA,tRNA,snRNA(核RNA)前體。由于hnRNA為mRNA前體,而mRNA在各種RNA中壽命最短,最不穩(wěn)定,需經(jīng)常合成,故酶II被認為是最重要的酶。(二)真核RNA聚合酶第57頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
1、啟動子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位,也就是使轉(zhuǎn)錄開始的部位。在基因表達的調(diào)控中,轉(zhuǎn)錄的起始是個關(guān)鍵。常常某個基因是否應(yīng)當表達決定于在特定的啟動子起始過程。
2、啟動子處的核苷酸順序具有特異的形狀以便與RNA聚合酶結(jié)合。
3、在RNA合成開始位點的上游大約10bp和35bp處有兩個共同的順序,稱為-10和-35序列。這兩個序列的共同順序如下:-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”;-10區(qū)“TTGACATATATT”。大多數(shù)啟動子均有共同順序只有少數(shù)幾個核苷酸的差別。
4、啟動子中的-10和-35序列是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序。
二、啟動子第58頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第59頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五三、終止子
-10序列又稱為Pribnow盒(原核生物)。在真核生物中相應(yīng)的序列位于-35bp處,稱為TATA盒,又稱為Goldberg-Hognessbox,是RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合部位。第60頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五五、轉(zhuǎn)錄與復制的異同相同:①模板:DNA
②原料:三磷酸核苷酸
③遵守堿基配對規(guī)律
④模板閱讀方向:3′→5′;新鏈合成方向:5′→3′
⑤酶:依賴DNA的聚合酶
⑥產(chǎn)物:多核苷酸鏈第61頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五不同:
復制
轉(zhuǎn)錄模板DNA雙鏈DNA模板鏈原料dNTPNTP
配對A←→T,G←→CA→U,T→A,
G←→C
酶DDDPDDRP
產(chǎn)物子代DNA(半保留)RNA(mRNAtRNA、
rRNA等)引物小段RNA不需要引物第62頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五可分為起始、延長、終止三個階段
1、轉(zhuǎn)錄過程以DDRP全酶辯認并結(jié)合DNA模板而開始。
2、隨著酶的向前移動(→5′),轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA
不斷延長。
3、當轉(zhuǎn)錄酶到達終止信號處,酶與DNA模板分離、產(chǎn)物RNA脫落、轉(zhuǎn)錄即告結(jié)束。
4、真核生物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還需有“轉(zhuǎn)錄后加工”的過程。三、RNA的轉(zhuǎn)錄過程第63頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第64頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五1、RNA聚合酶全酶辨認、結(jié)合到模板的啟動區(qū)在真核細胞還有一些特異調(diào)控DNA稱順式調(diào)控元件,還有一些辯認DNA的蛋白質(zhì)稱反式調(diào)控因子共同參與轉(zhuǎn)錄起始過程。(一)轉(zhuǎn)錄的起始第65頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五2、解開DNA雙鏈,形成“轉(zhuǎn)錄空泡”。
1)較早認為RNA聚合酶與DNA結(jié)合后,“擠入”雙螺旋結(jié)構(gòu)之內(nèi),使DNA解鏈,不需其他輔助因子。目前認為拓撲酶II也參與作用,形成負超螺旋,有利于轉(zhuǎn)錄。
2)解鏈的范圍不大(10—20bp)——形成轉(zhuǎn)錄空泡。第66頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第67頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五3、起動復合物形成,轉(zhuǎn)錄開始:不需引物,RNA聚合酶在起始部位催化兩個核苷酸形成磷酸二酯鍵。第一個核苷酸常為GTP,GTP與隨后的NTP生成
PPPGPN′-OH,仍保留三磷酸鳥苷狀態(tài)。因此常把[RNA聚合酶全酶-DNA-PPPGPN′
-OH]稱為轉(zhuǎn)錄的起始復合物。4、б因子從全酶脫落,可重復利用。第68頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第69頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
1、核心酶沿著模板滑動,催化四種NTP按堿基配對原則生成長的核苷酸鏈,方向5′→3′。核心酶經(jīng)過后,DNA雙鏈復合為雙螺旋,RNA鏈與模板分離。
2、因同一DNA上可多位點同時轉(zhuǎn)錄;又因DNA—DNA較DNA—RNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,故RNA易被排斥分離,在電鏡下,同一DNA模板上,長短不一的RNA鏈散開成羽毛狀圖形。
3、同時將轉(zhuǎn)錄過程形成的“酶-DNA-RNA”復合物稱為轉(zhuǎn)錄復合物。
4、對于較長的mRNA,可一邊轉(zhuǎn)錄、一邊與核糖體結(jié)合而開始“翻譯”過程。(二)轉(zhuǎn)錄的延長第70頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
DDRP(核心酶)在模板的“轉(zhuǎn)錄終止點”停頓,酶—模板分離,RNA脫落。1、依賴ρ因子幫助:
ρ因子幫助RNA聚合酶辯認終點并停止轉(zhuǎn)錄。ρ因子與RNA結(jié)合(主要與PolyC親和力最大)→RNA-DNA雜化雙鏈的短鏈變性→利于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復合物中釋放。ρ因子有ATP酶與解鏈酶活性。
2、不依賴ρ因子
RNA產(chǎn)物形成特殊結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。在近轉(zhuǎn)錄終止區(qū),轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物常出現(xiàn)多個“UUUU…..”結(jié)構(gòu),在此結(jié)構(gòu)之前,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成“發(fā)夾樣”或“柄鼓泡”樣結(jié)構(gòu),這種二級結(jié)構(gòu)是阻止轉(zhuǎn)錄繼續(xù)向下游推進的關(guān)鍵。(三)轉(zhuǎn)錄終止第71頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第72頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五第73頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五四、轉(zhuǎn)錄過程的抑制劑第74頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五無論原核或真核生物,初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都經(jīng)過一定程度的修飾和加工才表現(xiàn)功能。真核生物轉(zhuǎn)錄后加工修飾更復雜,故主要介紹真核生物。(一)mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工1、首尾修飾(1)5′端帶帽:即GPPPmG。其功能:一種翻譯起始因子可和帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合,故與翻譯過程有關(guān)。(2)3′端接尾;即PolyA,一般100~200bp。其功能:維持mRNA作為翻譯模板活性,增加mRNA穩(wěn)定性。五、轉(zhuǎn)錄后的加工第75頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
2、內(nèi)部剪接(1)斷裂基因(Splitgene)、外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)
〈a〉斷裂基因——真核生物的結(jié)構(gòu)基因常由若干個編碼區(qū)及非編碼區(qū)間隔連續(xù)鑲嵌而成,稱之
〈b〉外顯子——基因中(包括hnRNA)能編碼AA的片段。
〈c〉內(nèi)含子——基因中(包括hnRNA)非編碼AA的片段。原核生物結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)的編碼序列,無斷裂基因。第76頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五(2)mRNA的剪接:即剪去內(nèi)含子,拼接外顯子斷裂基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成hnRNA,hnRNA剪去內(nèi)含子,拼接外顯子,成為成熟的mRNA(二)tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工
tRNA為DDRPIII的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
1、剪接:去除插入的堿基。
2、生成各種稀有堿基:即除A、C、G、U以外的堿基,如DHU、ψ、I等。
〈1〉甲基化:A→Am,G→Gm〈2〉還原反應(yīng):U→DHU〈3〉核苷內(nèi)轉(zhuǎn)位反應(yīng):尿嘧啶核苷→假尿苷ψ(C5—C1′)
〈4〉脫NH3:A→I3、3′端加入CCA-OH未端,完成氨基酸臂的第77頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五(三)rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工
rRNA的基因(rDNA)屬豐富基因族的DNA序列,有高度重復序列,這些序列可被不能轉(zhuǎn)錄為mRNA的間隔區(qū)分隔組成?!匆弧祌RNA的加工:
rRNA在胞核內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成45S-rRNA,后者經(jīng)加工剪接形成18S-rRNA和經(jīng)拼接形成5.8s及28s-rRNA。三種rRNA一起和核糖體蛋白構(gòu)成核糖體,進入胞質(zhì)。
〈二〉rRNA的自我剪接與ribozyme(核酶)
研究發(fā)現(xiàn)一些低等真核生物細胞核的rRNA,其剪接不需任何蛋白質(zhì)參與,故認為RNA分子具有酶的活性,從而提出核酶的概念。
1、核酶(ribozyme):具有催化作用的RNA。主要參與RNA的自我剪接過程
2、核酶二級結(jié)構(gòu)——槌頭狀結(jié)構(gòu),包括有底物部位(含G、U序列)和催化部位(有三個莖及1或2個環(huán))。第78頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五一、概念:
基因工程是在體外將分離純化或人工合成的DNA與載體DNA結(jié)合,成為重組DNA,用以轉(zhuǎn)化宿主(細菌或其他細胞),然后篩選出能表達重組DNA的活細胞,加以純化、傳代、擴增,成為克隆的技術(shù)。因此基因工程也稱為基因克隆或重組DNA技術(shù)。克隆(Clone)——親代細胞通過無性繁殖而產(chǎn)生一組單一細胞的過程稱之。[克隆也表示從單一親代細胞通過無性繁殖而產(chǎn)生的一組單一的細胞。]第二節(jié)基因工程操作技術(shù)第79頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五已用限制性內(nèi)切酶切開的質(zhì)粒DNA給體DNA片段給體DNA重組質(zhì)粒染色體DNA細菌細菌的轉(zhuǎn)化與含重組質(zhì)粒的細菌的篩出已轉(zhuǎn)化的細菌細菌繁殖含該重組質(zhì)粒的細菌克隆株基因工程技術(shù)示意圖第80頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五〈一〉分——載體和目的基因的分離
1、常用載體:質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體等。此外還有逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA、昆蟲病毒DNA。對載體的要求:
〈1〉能獨立復制,但需宿主的酶體系進行基因表達。
〈2〉有篩選標記:如抗藥性基因。
〈3〉分子量不大,盡可能有多種內(nèi)切酶的單一位點。
〈4〉可通過破碎細菌,用密度梯度離心法分離。(5)容易進入受體細胞二、基因工程的五大步驟
——(分、切、接、轉(zhuǎn)、篩)第81頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五EcoRI0HindIII29BamHI375
SalI650
AvaI1425
PvuII2066
PstI3609耐氨芐青霉素基因耐四環(huán)素基因第82頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五
2、目的基因的來源:
〈1〉直接從染色體DNA分離,多用于原核生物。
〈2〉人工合成。
〈3〉從mRNA合成cDNA,需反轉(zhuǎn)錄酶。
第83頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五〈4〉基因文庫:是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體。包括
G—文庫(總DNA文庫)、
C—文庫(cDNA文庫)?;蛭膸熘苽溥^程:全部DNA分離提純,經(jīng)過酶切形成DNA片段,重組入同一個載體,成為重組體,再轉(zhuǎn)化到細菌保存起來。第84頁,共97頁,2023年,2月20日,星期五基因文庫包括:(1)G文庫——用基因組的總DNA來制備的稱之。(2)C文庫——用細胞全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,以之來建庫。應(yīng)用“探針”可把目的基因釣出。第85頁,共9
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