工業(yè)微生物育種誘變劑課件

第五章工業(yè)微生物育種誘變劑本章內(nèi)容：化學(xué)誘變劑物理誘變劑生物誘變劑2

誘變：通過(guò)人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微生物以引起突變，這一過(guò)程稱(chēng)為誘發(fā)突變。5

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在DNA復(fù)制過(guò)程中取代正常堿基，整合進(jìn)DNA分子

它們產(chǎn)生異構(gòu)體的頻率高，出現(xiàn)堿基錯(cuò)配的概率也高堿基類(lèi)似物是如何提高突變頻率的?（一）堿基類(lèi)似物的誘變機(jī)制——現(xiàn)以5-BU為例來(lái)分析堿基類(lèi)似物的誘變機(jī)制。當(dāng)胸腺嘧啶分子結(jié)構(gòu)中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取代，就構(gòu)成了5-BU的結(jié)構(gòu)式。

5-溴尿嘧啶（5-BU）的結(jié)構(gòu)9

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G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUk

A:TA:BUk

A:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU摻入錯(cuò)誤A:T→G≡C由于5-BU的誘變作用是在DNA復(fù)制過(guò)程中實(shí)現(xiàn)的，因此，處在靜止或休眠狀態(tài)的細(xì)胞是不適合的。細(xì)菌采用對(duì)數(shù)期的細(xì)菌，霉菌、放線菌采用孢子，但要進(jìn)行前培養(yǎng)，使孢子處于萌動(dòng)狀態(tài)，并要加大5-BU的濃度，處理過(guò)程要進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。13

（二）堿基類(lèi)似物的誘變處理方法（以5-BU為例）5-BU是白色結(jié)晶粉末，能溶于水或乙醇。誘變處理方法如下：1.單獨(dú)處理新鮮斜面的細(xì)菌——轉(zhuǎn)接到前培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中——培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期——離心除去培養(yǎng)液——加入生理鹽水或緩沖液——饑餓培養(yǎng)8—10小時(shí)——加入5-BU到培養(yǎng)液中，使最后的處理濃度為25—40μg/ml,混合均勻——取0.1—0.2ml菌懸液加入到瓊脂平板上涂布培養(yǎng)——在適宜溫度下，使之在生長(zhǎng)過(guò)程中誘變處理——培養(yǎng)后挑取單菌落，進(jìn)行篩選。真菌、放線菌孢子，則要提高5-BU的濃度（0.1—1mg/ml），加到孢子懸液后，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(shí)(一般6—12h)——分離于平皿——適溫培養(yǎng)——挑取單菌落，進(jìn)行篩選。2.與輻射線復(fù)合處理?yè)?jù)報(bào)道，如果菌體先用5-BU等堿基類(lèi)似物進(jìn)行處理，使它們首先滲入到DNA分子中，然后用輻射線照射，誘變效果會(huì)比單獨(dú)使用輻射線更好。因此，堿基類(lèi)似物也是一種輻射誘變的增敏劑。17

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亞硝酸的脫氨基作用及其誘發(fā)的突變

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A:TG┆C如果是處理細(xì)菌，亞硝酸最后濃度以0.05mol/L為例：將斜面新鮮菌體移入肉湯培養(yǎng)基，適溫培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，棄去上清液，用生理鹽水洗滌。pH4.5醋酸緩沖液和0.1mol/L硝酸鈉溶液1:1濃度加入沉淀的菌體中，使之懸浮。于35—37℃處理5—10min、加入5倍的pH8.6的磷酸氫二鈉溶液，使pH下降到6.8。取一定量進(jìn)行后培養(yǎng)1.5—2h。然后稀釋分離于平板上。注：在亞硝酸處理菌體或孢子時(shí)要嚴(yán)格控制好溫度，否則會(huì)影響誘變效果。22

羥胺的誘變機(jī)制改變了結(jié)構(gòu)的胞嘧啶——烷化劑是誘發(fā)突變中一類(lèi)相當(dāng)有效的化學(xué)誘變劑，這類(lèi)誘變劑具有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，它們易取代DNA分子中活潑的氫原子，直接與一個(gè)或多個(gè)堿基起烷化反應(yīng)，從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，引起突變。雙功能烷化劑單功能烷化劑多功能烷化劑根據(jù)烷化劑中活性烷基的數(shù)目亞硝基類(lèi)、磺酸酯類(lèi)、硫酸酯類(lèi)、重氮烷類(lèi)、乙烯亞胺類(lèi)化合物硫芥子、氮芥子類(lèi)等26

烷化堿基部分烷化劑部分烷化劑

和

烷化堿基

甲基磺酸甲酯亞硝基乙基脲7-甲基鳥(niǎo)嘌呤3-甲基腺嘌呤O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤如果鳥(niǎo)嘌呤N7等位點(diǎn)被烷化后，它和核糖結(jié)合鍵發(fā)生水解反應(yīng)，引起鳥(niǎo)嘌呤從DNA分子上脫落下來(lái)，使DNA鏈上堿基空缺，在以后的復(fù)制過(guò)程中其它游離堿基有可能錯(cuò)誤摻入。GC就可能變?yōu)槿魏螇A基對(duì)G:C——A:T轉(zhuǎn)換及G:C——C:G或G:C——T:A顛換而導(dǎo)致突變。由于烷基化后的鳥(niǎo)嘌呤，易離子化，由原來(lái)的酮式變?yōu)椴环€(wěn)定的烯醇式，不能和胞嘧啶配對(duì)，而是與胸腺嘧啶錯(cuò)誤配對(duì)，結(jié)果發(fā)生G:C——A:T轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致突變。

烷化鳥(niǎo)嘌呤的堿基配對(duì)

烷化劑除了以上誘變作用之外，還有可能使兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤N7位點(diǎn)形成共價(jià)鍵，一般雙功能烷化劑容易引起DNA雙鏈間的交聯(lián)，造成變異或死亡。33

總結(jié)鳥(niǎo)嘌呤N7位點(diǎn)的烷化作用烷化劑的性質(zhì)——烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)生水解?！鼈兇蟛糠职胨テ诤芏蹋溟L(zhǎng)度與溫度、溶液pH關(guān)系很大。因此，化學(xué)誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配?！簧偻榛瘎┮?jiàn)光后，容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，和水解作用一樣，有的分解產(chǎn)物會(huì)失去誘變作用或具毒性。因此，保藏時(shí)要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。——另外，配制烷化劑溶液時(shí)，要采用合適的pH緩沖液。烷化劑名稱(chēng)理化特性pH7水中半衰期/h分子量狀態(tài)水溶性溶點(diǎn)或沸點(diǎn)20℃30℃37℃甲基磺酸乙酯(EMS)無(wú)色液體約8%沸點(diǎn)85~86℃/10mmHg932610.4124乙烯亞胺(EI)無(wú)色液體易溶于水沸點(diǎn)56℃/760mmHg43亞硝基乙基脲(NEU)粉紅色液約5%沸點(diǎn)53℃/5mmHg84117亞硝基甲基脲(NMU)黃色固體35103硫酸二乙酯(DES)無(wú)色油狀物不易溶3.3410.5亞硝基胍(NTG)黃色固體熔點(diǎn)118℃烷化劑的某些性質(zhì)幾種常用的烷化劑：1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（簡(jiǎn)稱(chēng)亞硝基胍，NTG或NG或MNNG）為黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光易分解，放出NO，顏色由黃色變?yōu)榫G色，誘變效應(yīng)降低。須保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低溫條件下貯存。NTG不溶于水，須加助溶劑，使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用。NTG有超誘變劑之稱(chēng)，能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效果好，尤其適合于誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。其中處理細(xì)菌、放線菌等微生物時(shí)，不經(jīng)淘汰，就可以直接得到10%以上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。而用一般誘變劑處理只能達(dá)百分之幾至千分之幾。NTG的水溶液中隨著不同的pH將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物，從而影響誘變效應(yīng)。當(dāng)溶液pH低于5.5時(shí)，NTG分解成HNO2,HNO2本身就具誘變作用；當(dāng)溶液pH在8.0以上時(shí)，NTG會(huì)分解產(chǎn)生重氮甲烷（CH2N2），對(duì)核酸起烷化作用，引起微生物突變；當(dāng)溶液pH為6.0時(shí)，NTG本身和DNA起烷化反應(yīng)而導(dǎo)致突變。通常在pH6.0的條件下進(jìn)行誘變處理。由于酸堿條件影響NTG的誘變效果，因此，無(wú)論是配制NTG溶液，還是制備均懸液都要用適宜的緩沖溶液。常用的由磷酸緩沖液和Tris緩沖液.1.取新鮮的斜面，用一定pH值的緩沖液或Tris緩沖液洗下細(xì)菌制成菌懸液。如果采用細(xì)菌細(xì)胞或絲狀菌孢子（真菌或放線菌）須進(jìn)行前培養(yǎng)，可用有關(guān)培養(yǎng)基代替以上緩沖液，孢子培養(yǎng)時(shí)間控制在大部分孢子處在萌動(dòng)階段，經(jīng)離心、洗滌，用緩沖液制成懸液，濃度約在106-107ml-1；NTG的誘變處理方法：2.配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶劑甲酰胺或丙酮少許，然后加緩沖溶液，其比例為9：1（緩沖溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液濃度配成1mg/ml。使用時(shí)取母液0.2ml，加菌懸液1.8ml，NTG最后處理濃度為100μg/ml。一般處理濃度隨菌種不同而異，通常細(xì)菌為100—1000μg/ml，而放線菌、真菌孢子為1000—3000μg/ml。3.將以上菌懸液和NTG溶液混合于一試管內(nèi)，置該菌生長(zhǎng)適宜的溫度下保溫處理若干時(shí)間。4.終止反應(yīng)。用冷的生理鹽水稀釋到50倍以上或在低溫下進(jìn)行離心洗滌，除去藥液，加無(wú)菌水使沉淀懸浮并作成一定稀釋度分離于平皿。處理完畢后，馬上把接觸過(guò)NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡處理。除以上直接以溶液處理外，也可以進(jìn)行如下方法誘變處理：1.搖瓶振蕩處理2.在平皿上生長(zhǎng)過(guò)程處理NTG是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，操作時(shí)要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱(chēng)量瓶稱(chēng)量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過(guò)NTG的器皿必須及時(shí)、單獨(dú)處理，例如用自來(lái)水大量沖洗或用1—2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡過(guò)夜，洗凈。42

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溴化乙錠（EtBr）由美國(guó)的腫瘤研究所合成，故名。這是一些由烷化劑與吖啶類(lèi)化合物相結(jié)合的化合物。44

B嵌入到舊鏈上導(dǎo)致插入突變A嵌入到新合成鏈上導(dǎo)致缺失突變移碼誘變劑的嵌入并不導(dǎo)致突變，必須通過(guò)DNA的復(fù)制才形成突變，因此這類(lèi)誘變劑只能作用于生長(zhǎng)態(tài)的細(xì)胞。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中利用溴化乙錠能嵌入到DNA分子的特性，將其作為常用的DNA染料；在微生物遺傳育種中溴化乙錠是酵母菌小菌落突變型的有效誘變劑。46

重視化學(xué)誘變劑的操作安全化學(xué)誘變劑多數(shù)是極毒的致癌藥品，在進(jìn)行誘變操作后的處置以及誘變劑的保藏等方面的安全防護(hù)都是及其重要的。如有疏忽，就可能對(duì)人體健康的環(huán)境帶來(lái)惡果，萬(wàn)萬(wàn)不可麻痹。使用化學(xué)誘變劑一般要求避光、密封、低溫、干燥等；盡可能不觸及人體任何部位；對(duì)殘余物要及時(shí)進(jìn)行消毒、稀釋處理。48

——物理誘變劑是指通常使用物理輻射中的各種射線，包括紫外線、X射線、γ射線、快中子、α射線、β射線、微波、超聲波、電磁波、激光射線和宇宙線等。50

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誘變劑在DNA上的初級(jí)效應(yīng)遺傳反應(yīng)堿基類(lèi)似物摻入作用AT?GC轉(zhuǎn)換羥胺同胞嘧啶起羥化反應(yīng)GC→AT轉(zhuǎn)換亞硝酸A、C的脫氧基作用DNA交聯(lián)AT→GC轉(zhuǎn)換缺失烷化劑烷化堿基（主要是G）而導(dǎo)致：脫嘌呤作用；烷化堿基的互變異構(gòu)作用；DNA鏈的交聯(lián)作用；糖-磷酸骨架的斷裂堿基置換（AT?GC轉(zhuǎn)換、AT→TA顛換、GC→CG顛換）及染色體畸變吖啶類(lèi)個(gè)別堿基的插入或缺失移碼突變紫外線照射形成嘧啶二聚體；形成嘧啶的水合物；DNA交聯(lián)；DNA斷裂AT→GC轉(zhuǎn)換、AT→GC顛換、及移碼突變電離輻射脫氧核糖-堿基之間化學(xué)鍵及脫氧核糖-磷酸之間化學(xué)鍵的斷裂；通過(guò)自由基對(duì)DNA的作用AT?GC轉(zhuǎn)換、移碼突變及染色體畸變60

20世紀(jì)80年代初，人們?cè)诓捎媚承┦删w來(lái)篩選抗噬菌體突變菌株時(shí)，發(fā)現(xiàn)常伴隨著出現(xiàn)抗生素產(chǎn)量