蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離分析

一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側鏈上存在游離的氨基和羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì)，具有特定的等電點（pI）。溶液pH＝pI時，蛋白質(zhì)所帶正負電荷相等；

pH＞pI時，蛋白質(zhì)帶凈負電荷；

pH＜pI時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。現(xiàn)在是1頁\一共有45頁\編輯于星期五等電點時特點：（1）凈電荷為零（2）一定離子強度的緩沖液：等離子點特征常數(shù)（3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點偏酸

堿性AA/酸性AA等電點胃蛋白酶0.21.0

血紅蛋白1.76.7

細胞色素C2.910.7

菊糖酶0.348.2（4）導電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。等電沉淀和蛋白電泳：

遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關現(xiàn)在是2頁\一共有45頁\編輯于星期五帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。電泳：What’selectrophoresis?一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點現(xiàn)在是3頁\一共有45頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負電荷或正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可互相分離。一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點現(xiàn)在是4頁\一共有45頁\編輯于星期五二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達1~100nm，處于膠體顆粒的范圍。（親水膠體）蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。1、蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)現(xiàn)在是5頁\一共有45頁\編輯于星期五二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)2、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個重要因素：水化膜

通過氫鍵與水結合表面電荷

在非等電點狀態(tài)下，雙電層，帶同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。

現(xiàn)在是6頁\一共有45頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用現(xiàn)在是7頁\一共有45頁\編輯于星期五3.蛋白質(zhì)凝膠凝膠作用：蛋白質(zhì)顆粒周圍的水膜是不均勻,使它們以一定的部位結合形成長鏈。這些長鏈又彼此結合成為復雜的網(wǎng)狀結構的凝膠體。溶膠：蛋白質(zhì)作為分散相，水為連續(xù)相形成的溶液。凝膠：蛋白質(zhì)為連續(xù)相，水為分散相形成的網(wǎng)狀凝膠體。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)現(xiàn)在是8頁\一共有45頁\編輯于星期五3.蛋白質(zhì)凝膠凝膠具有脹潤作用：分類：（1）可逆性凝膠

（2）不可逆性凝膠部分破壞水化膜、適當加熱和遠離等電點4.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應用滲析（透析）超濾二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)現(xiàn)在是9頁\一共有45頁\編輯于星期五三、蛋白質(zhì)的變性、復性與凝固作用

在某些物理或化學因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴格的空間結構被破壞（肽鍵不斷裂，一級結構不變），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。

What’sdenaturationofprotein?現(xiàn)在是10頁\一共有45頁\編輯于星期五1、變性理論

蛋白質(zhì)的變性就是天然蛋白質(zhì)分子中肽鏈的高度規(guī)則的緊密排列方式因氫鍵及其他次級鍵的破壞而變成不規(guī)則的松散排列方式。2、引起蛋白質(zhì)變性的因素：①物理因素：

高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波、機械攪拌②化學因素：

強酸、強堿、有機溶劑、尿素、胍、重金屬鹽等。變性的因素及作用機制現(xiàn)在是11頁\一共有45頁\編輯于星期五①物理性質(zhì)：

旋光性改變，溶解度下降，結晶能力下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學性質(zhì)：

官能團反應性增加，呈色反應增強，易被蛋白酶水解。③生物學性質(zhì)：

原有生物學活性喪失，抗原性改變。

變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變現(xiàn)在是12頁\一共有45頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)變性的可逆性－復性：某些蛋白質(zhì)變性后可以在一定的條件下重新形成原來的空間結構，并恢復原來部分理化特性和生物學活性，這個過程稱為蛋白質(zhì)的復性（renaturation）。蛋白質(zhì)變性的可逆性與復性蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下不能復性；如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構象未被嚴重破壞；或蛋白質(zhì)具有特殊的分子結構,并經(jīng)特殊處理則可以復性?，F(xiàn)在是13頁\一共有45頁\編輯于星期五核糖核酸酶的變性與復性去除變性劑并緩慢氧化天然構象尿素，-巰基乙醇變性狀態(tài)現(xiàn)在是14頁\一共有45頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)變性的可逆性與復性

可逆變性：變性條件除去后仍可恢復天然狀態(tài)的變性。

不可逆變性：變性條件除去后不能恢復天然狀態(tài)的變性?，F(xiàn)在是15頁\一共有45頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)的熱變性與凝固作用1、熱變性

熱變性的定義熱變性三個階段影響熱變性的因素:

溫度、砂糖、H+濃度、蛋白質(zhì)含水量、電解質(zhì)；現(xiàn)在是16頁\一共有45頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)的熱變性與凝固作用2、蛋白質(zhì)的凝固作用天然蛋白質(zhì)變性后，變性蛋白質(zhì)分子互相凝集或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象成為蛋白質(zhì)的凝固（coagulation）。凝固作用分兩個階段：

首先是變性；

其次失去規(guī)律性的肽鏈聚集纏繞在一起而凝固或結絮;現(xiàn)在是17頁\一共有45頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)變性的應用

理論上：研究蛋白質(zhì)分子結構與功能,分子量測定,亞單位拆分；

生產(chǎn)生活中有利的一面：食品加工，消毒滅菌等；非蛋白生物物質(zhì)提取純化，終止酶促反應；

生產(chǎn)生活中不利的一面：活性蛋白制品（酶、抗體）的分離提取和保存；現(xiàn)在是18頁\一共有45頁\編輯于星期五外加一些因素去除蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素后，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀（precipitation）。1.What’sprecipitationofprotein?變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì)。四、蛋白質(zhì)的沉淀作用現(xiàn)在是19頁\一共有45頁\編輯于星期五2.沉淀種類：可逆與不可逆四、蛋白質(zhì)的沉淀作用3.沉淀方法：沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法現(xiàn)在是20頁\一共有45頁\編輯于星期五2.沉淀種類：可逆與不可逆四、蛋白質(zhì)的沉淀作用3.沉淀方法：沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法（1）鹽析－中性鹽沉淀法（2）有機溶劑沉淀法（3）酸沉淀法現(xiàn)在是21頁\一共有45頁\編輯于星期五（1）鹽析—中性鹽沉淀鹽溶作用鹽析作用What’ssaltprecipitationofprotein?蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法現(xiàn)在是22頁\一共有45頁\編輯于星期五（1）鹽析—中性鹽沉淀定義：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析（saltprecipitation）。作用機制:

中和電荷的同時破壞水化膜;What’ssaltprecipitationofprotein?蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法現(xiàn)在是23頁\一共有45頁\編輯于星期五常用的中性鹽：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時，pH在蛋白質(zhì)的等電點處效果最好。鹽析沉淀蛋白質(zhì)通常不會引起蛋白質(zhì)的變性。優(yōu)點鹽析應用舉例（1）鹽析—中性鹽沉淀蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法現(xiàn)在是24頁\一共有45頁\編輯于星期五分段鹽析：

半飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較大的血漿球蛋白,而飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較小的血漿清蛋白。因此,使用不同濃度的硫酸銨溶液就可將分子量不同的蛋白質(zhì)進行初步分離。（1）鹽析—中性鹽沉淀現(xiàn)在是25頁\一共有45頁\編輯于星期五凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。沉淀原理：①脫水作用——破壞水化膜；②使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。（2）有機溶劑沉淀法蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法現(xiàn)在是26頁\一共有45頁\編輯于星期五處理條件：①低溫操作；②沉淀完全后盡快分離；（2）有機溶劑沉淀法蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法機制：破壞電荷，等電點沉淀。（3）酸沉淀法現(xiàn)在是27頁\一共有45頁\編輯于星期五（1）重金屬鹽沉淀法（2）生物堿試劑沉淀法（除蛋白作用）（3）熱凝固沉淀法（4）抗體對抗原蛋白質(zhì)的沉淀3.沉淀方法：沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法四、蛋白質(zhì)的沉淀作用現(xiàn)在是28頁\一共有45頁\編輯于星期五沉降的概念沉降速率：v=dx/dt沉降常數(shù)與單位應用：

沉降速度法測定分子量的原理；梯度離心分離蛋白質(zhì)（氯化銫）；五、蛋白質(zhì)的沉降作用現(xiàn)在是29頁\一共有45頁\編輯于星期五六、蛋白質(zhì)的顏色反應1.雙縮脲反應2.茚三酮反應3.考馬斯亮藍G2504.福林酚試劑反應5.黃色反應--芳香族氨基酸的特有反應6.米倫氏反應—酪氨酸的特有反應7.乙醛酸反應—色氨酸的特有反應8.坂口反應—精氨酸特有的反應現(xiàn)在是30頁\一共有45頁\編輯于星期五六、蛋白質(zhì)的顏色反應1.雙縮脲反應兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色復合物含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣反應肽鍵的反應，肽鍵越多顏色越深，粉紅，紫紅，藍紫受蛋白質(zhì)特異性影響小蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度現(xiàn)在是31頁\一共有45頁\編輯于星期五六、蛋白質(zhì)的顏色反應2.茚三酮反應

靈敏度差。3.考馬斯亮藍G-250本身為棕色，與蛋白質(zhì)反應呈藍色與蛋白的親和力強，靈敏度高11000微克/毫升現(xiàn)在是32頁\一共有45頁\編輯于星期五六、蛋白質(zhì)的顏色反應4.福林酚試劑反應酪氨酸、色氨酸的反應（還原反應）福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸與雙縮脲法結合Lowry法在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應蛋白質(zhì)-銅絡合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍和磷鎢藍混合物靈敏度提高100倍現(xiàn)在是33頁\一共有45頁\編輯于星期五六、蛋白質(zhì)的顏色反應5.黃色反應--芳香族氨基酸的特有反應濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應生成黃色化合物指甲、皮膚、毛發(fā)6.米倫氏反應—酪氨酸的特有反應酪氨酸的顯色反應（酚羥基反應）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色現(xiàn)在是34頁\一共有45頁\編輯于星期五六、蛋白質(zhì)的顏色反應7.乙醛酸反應—色氨酸的特有反應在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應（吲哚環(huán)的反應）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸現(xiàn)在是35頁\一共有45頁\編輯于星期五六、蛋白質(zhì)的顏色反應8.坂口反應—精氨酸特有的反應精氨酸的反應（胍基的反應）精氨酸與α-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸定量測定精氨酸現(xiàn)在是36頁\一共有45頁\編輯于星期五七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm

附近顯示強的吸收?？梢詫Φ鞍踪|(zhì)進行定性和定量檢測。蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）

=1.45A280—0.74A260現(xiàn)在是37頁\一共有45頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)的分離純