轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)原理與應用

利用小鼠動物模型

研究基因表達與病理發(fā)育

鄭耀武轉(zhuǎn)基因動物實驗中心綜合實驗樓20585098583現(xiàn)在是1頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)原理與應用第一部分： 常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理第二部分： 基因定位修飾技術(shù)原理第三部分：

CRISPR/Cas9技術(shù)原理與應用現(xiàn)在是2頁\一共有87頁\編輯于星期二第一部分常規(guī)轉(zhuǎn)基因動物原理與應用現(xiàn)在是3頁\一共有87頁\編輯于星期二什么是轉(zhuǎn)基因？狹義：人為將DNA片段插入基因組廣義：人為的對生物基因組的修飾，包括隨機的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定點突變等現(xiàn)在是4頁\一共有87頁\編輯于星期二動物轉(zhuǎn)基因的重要性基礎理論研究

（小鼠）研究基因調(diào)節(jié)，包括啟動子功能基因功能追蹤（Knockout，GeneTrap）細胞追蹤，如癌細胞轉(zhuǎn)移（如EGFP基因敲入）基因表達與胚胎發(fā)育，器官發(fā)育基因表達與生物學功能、病理發(fā)育基因突變體表達功能研究基因相互作用應用研究（大動物）生產(chǎn)活性蛋白：酶，疫苗，抗體，生長因子，蛋白藥（蛋白活性要求特異的翻譯后修飾）低生產(chǎn)成本：轉(zhuǎn)基因動物可以傳代，可以連續(xù)生產(chǎn)，如血漿蛋白，乳蛋白，比細胞培養(yǎng)成本低病理動物模型，利用動物模型研究疾病發(fā)生機理、藥效測試器官移植：解決器官不足，重復感染問題，如豬肝臟品種改良(GMO)：抗病，高產(chǎn)，營養(yǎng)價值提升疾病治療：治療遺傳缺陷，組織再生現(xiàn)在是5頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究歷史第一個轉(zhuǎn)基因小鼠：1974年第一個小鼠干細胞：1981年第一個基因捕獲小鼠：1989年第一個基因敲除小鼠：1997年第一個克隆動物：2008年第一個CRISPR/CAS9小鼠RudolfJaenischin1974.JaenishsuccessfullymanagedtoinsertforeignDNAintoearly-stagemouseembryoresultingmicecarriedmodifiedgeneinalltheirtissuesandprogeny.Gossler,A.,A.L.Joyner,etal.(1989)."Mouseembryonicstemcellsandreporterconstructstodetectdevelopmentallyregulatedgenes."Science244(4903):463-5.

MartinGR.Isolationofapluripotentcelllinefromealrymouseembryosculturedinmediumconditionedbyteratocarcinomastemcells.ProcNatlAcadSci

(USA).1981;78:7634-8.HooperM,HardyK,HandysideA,HunterS,MonkM.HPRT-deficient(Lesch-Nyhan)mouseembryosderivedfromgermlinecolonizationbyculturedcells.Nature.1987;326:292-5.

MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.Science.2013Feb15;339(6121):819-23.doi:10.1126/science.1231143.Epub2013Jan3.Dolly(5July1996–14February2003)wasafemaledomesticsheep,andthefirstmammaltobeclonedfromanadultsomaticcell,usingtheprocessofnucleartransfer.現(xiàn)在是6頁\一共有87頁\編輯于星期二常見轉(zhuǎn)基因技術(shù)常規(guī)方法：受精卵細胞核DNA顯微注射，隨機插入，預見性低，但多樣性利用精子轉(zhuǎn)染DNA，效率低，重復性差利用轉(zhuǎn)坐子進行DNA在基因組的插入，方法復雜，受限多病毒感染：效率高，隨機性低，可帶DNA大小受限制，安全隱患，常用于大動物干細胞／胚胎顯微注射：常用于小鼠基因定位修飾，預見性高，費時，大動物不成功核移植／動物克?。捍髣游锘蚨ㄎ恍揎椢ㄒ煌緩紺RISPR/Cas9技術(shù)：最新發(fā)展的，快速、簡便、高效基因組修飾技術(shù)現(xiàn)在是7頁\一共有87頁\編輯于星期二真核基因結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)真核基因結(jié)構(gòu)（ciselement)：啟動子(promoter)，外顯子(exon)，內(nèi)含子(intron)，polyA信號,活化信號（enhancers),沉默信號（silencers），封閉區(qū)(Insulators)轉(zhuǎn)錄因子(transelement)(transcriptionfactors)，活化因子(activators)，抑制因子(inhibitors)真核mRNA結(jié)構(gòu)：Cap，5’非編碼區(qū)(5’-UT)，編碼區(qū)(codingregion)，3’非編碼區(qū)(3’-UT)，polyA組織專一性調(diào)節(jié)(tissue-specificregulation,spatial)發(fā)育階段調(diào)節(jié)(developmentalregulation,timingly)誘導性調(diào)節(jié)(inducible)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié):mRNA剪接和修飾，mRNA的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)合成效率，蛋白質(zhì)半衰期

現(xiàn)在是8頁\一共有87頁\編輯于星期二基因結(jié)構(gòu)圖示mRNA結(jié)構(gòu)IV3’-UTAATAAAExonIGG5’-UTRAAAAAAAAA3’-UTRIIIIIIVIntronI翻譯起始點ExonIICCAATboxTATAboxEnhancer轉(zhuǎn)錄起始點ExonI5’UT…現(xiàn)在是9頁\一共有87頁\編輯于星期二基因轉(zhuǎn)錄復合體現(xiàn)在是10頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建啟動子選取cDNA選取PolyA選用內(nèi)含子和封閉區(qū)載體構(gòu)建現(xiàn)在是11頁\一共有87頁\編輯于星期二啟動子的類型和選取特異啟動子：研究基因調(diào)節(jié)（lacZ），啟動子功能，調(diào)節(jié)其它基因表達。用于其它基因表達，一定要查詢啟動子在轉(zhuǎn)基因動物應用文獻，了解啟動子完整性高表達啟動子選用：用于高表達某個基因，高表達蛋白生產(chǎn)廣譜啟動子應用：顯示基因細胞標記（EGFP）可誘導啟動子的應用：用于基因調(diào)節(jié)，有毒蛋白表達，致命基因的調(diào)控復合啟動子：可誘導、高表達、組織專一基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)，用于調(diào)節(jié)基因或高表達蛋白現(xiàn)在是12頁\一共有87頁\編輯于星期二表達基因（cDNA）的類別顯示基因(reporters):lacZ,GFP,CAT,AP等調(diào)節(jié)基因:Cre,ER-Cre,tTA,tTR,PTX等蛋白質(zhì)功能研究：蛋白突變體的表達基因剪接：研究外顯子、內(nèi)含子功能商業(yè)基因：藥用蛋白，改良基因等生理功能基因:基因治療，干細胞移植等非編碼基因：非編碼RNA功能研究，siRNA基因沉默,CRISPR/Cas9gRNA基因組修飾抗性基因：細胞篩選現(xiàn)在是13頁\一共有87頁\編輯于星期二其它轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)件選取polyA

：提供穩(wěn)定的mRNA常用polyA:SV40polyA,-GlobinpolyA內(nèi)含子選用：第一個內(nèi)含子，如-Globin內(nèi)含子封閉區(qū)應用：增加表達幾率，減少對周圍或被周圍基因影響Loxp,FRT,tetO序列現(xiàn)在是14頁\一共有87頁\編輯于星期二基因A啟動子典型轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)（Heterologous）CCAATboxTATAboxEnhancer轉(zhuǎn)錄起始點基因BcDNA翻譯起始點基因CpolyA5’-UT3’-UT拼接區(qū)域：現(xiàn)在是15頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因動物（Founders）鑒定檢測轉(zhuǎn)基因在基因組插入：PCRSouthern拷貝數(shù)：Southern,RealtimePCR插入位點：InversePCRmRNA表達：InSituRT-PCRNorthern蛋白表達：顯示基因：酶活性分析lacZ，Luciferase，AP,熒光EGFP,RFP功能分析：結(jié)構(gòu)變化：石蠟切片，H&E染色免疫組織化學、免疫熒光定位：冰凍切片，抗體染色免疫沉淀：Western現(xiàn)在是16頁\一共有87頁\編輯于星期二小鼠生物學基礎及轉(zhuǎn)基因優(yōu)越性小鼠免疫力強，繁殖率高，體型小，為經(jīng)濟有效動物模型小鼠遺傳表型多樣，全基因組序列解析，經(jīng)典哺乳類實驗動物模型多種自交系孕期19－21天性成熟時間：母4－5周，雄5-6周母鼠發(fā)情周期5天左右成鼠體重：20-50克母鼠平均產(chǎn)子5－6窩，自交系每窩6-8只，遠交系10-14只現(xiàn)在是17頁\一共有87頁\編輯于星期二產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鼠標準條件和要求

潔凈動物房，高蛋白，高脂肪飼料（Breederchows)供卵鼠：4-6周雜交子一代母鼠(C57B6xCBAorDBA),每次10-12只，每周兩次種鼠：年齡兩月到一年的雜交子一代雄鼠(C57B6xCBAorDBA)20-24只代孕母鼠：每次見栓2-5只，2-6月高繁殖率母鼠(CD1)50-100只結(jié)扎公鼠：(C57B6xCBAorDBA)子一代或(CD1)雄鼠，各需求10-20只，適用年齡2-18月現(xiàn)在是18頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因小鼠具體操作過程構(gòu)建載體，純化DNA片段，去除原核載體序列促排卵激素超排卵，合籠，分離E0.5受精卵DNA顯微注射胚胎培養(yǎng)過夜胚胎回移代孕鼠切尾鑒定傳代雜交表達分析現(xiàn)在是19頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因鼠建立時間表注射出生分窩傳代F1出生分窩分析孕期轉(zhuǎn)基因鼠鑒定傳代鑒定性成熟孕期時間（月）012345出生率30－50%轉(zhuǎn)基因比率15－50%傳代效率

~90%性成熟現(xiàn)在是20頁\一共有87頁\編輯于星期二供體受精卵收集，每次100－200個供體受精卵細胞核DNA顯微注射濃度:2-5ng/ul受精卵回移代孕母鼠:每只移植20-30個左右雙細胞卵

PCR或Southern篩選轉(zhuǎn)基因鼠(founders),15-50%,隨機插入，拷貝數(shù)1-≥100

第一代下傳（F1)0-100%，有卵裂后插入或兩個以上的插入位點

第二帶下傳，蒙德爾遺傳，50％表達功能分析：從E10到5個月轉(zhuǎn)基因鼠產(chǎn)生相關(guān)的數(shù)據(jù)現(xiàn)在是21頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因常見問題啟動子不完整，造成基因不表達或錯誤表達DNA插入隨機性造成不表達、低表達、鼠系間差異封閉區(qū)(insulaters)序列基因高表達毒性，得不到轉(zhuǎn)基因鼠或不表達第一個內(nèi)含子重要性轉(zhuǎn)基因片段的大?。?kb到>1000kb大部分2-10kb,容易注射P1質(zhì)粒(PAC),70kb左右，黏度大細菌人工染色體BAC，120kb左右，黏度更大酵母人工染色體YAC，500kb-1000kb，非常難注射同時注射兩個以上的轉(zhuǎn)基因：效率高，一般插入同一位點多拷貝插入方式：頭尾相接拷貝數(shù)與表達水平：無緊密關(guān)聯(lián)，多數(shù)拷貝被甲基化，轉(zhuǎn)錄因子濃度限制其它因素：DNA濃度(2-3ng/ul)，酒精、嗅化乙錠和EDTA殘留載體骨架DNA對轉(zhuǎn)基因表達影響：原核序列不穩(wěn)定C57/BL6純系轉(zhuǎn)基因鼠受精卵注射：效率略低現(xiàn)在是22頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因動物原理及應用第一部分： 常規(guī)動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理第二部分：

基因定位修飾技術(shù)原理第三部分：

CRISPR/Cas9技術(shù)原理與應用現(xiàn)在是23頁\一共有87頁\編輯于星期二第二部分：基因定位修飾基因定位修飾原理基因定位修飾過程基因定位修飾應用

現(xiàn)在是24頁\一共有87頁\編輯于星期二基因定位修飾重要性基因功能研究：隨著基因組解析，基因敲除和基因定位修飾進行基因功能解析基因調(diào)節(jié)：可以人為控制基因位點準確修飾，基因調(diào)節(jié)更為精確，研究結(jié)果更確定，病理模型更有價值基因修飾穩(wěn)定性，低拷貝，對基因組影響小，表達特定蛋白，大動物克隆，抗體基因組置換基因治療：準確定位修飾，結(jié)合人類干細胞培養(yǎng)和CRISPR/Cas9技術(shù)，是將來基因治療(GeneTherapy)、組織再生(RegenerationMedicine)重要途徑現(xiàn)在是25頁\一共有87頁\編輯于星期二小鼠早期發(fā)育示意圖3.5天現(xiàn)在是26頁\一共有87頁\編輯于星期二干細胞特性祖細胞(projenitorcells)的特性可以分化成少數(shù)不同種類細胞的原性細胞，可以進行有限次數(shù)的不等分裂干細胞(stemcell)的特性可以分化成多種組織器官、不斷增殖的少數(shù)細胞胚胎干細胞(ES)具有全能性每個細胞可以發(fā)育分化成任何組織器官、個體小鼠胚胎干細胞來源：囊胚內(nèi)細胞群(ICM)來源種系：多數(shù)129SV/jae,少數(shù)C57/BL6毛色：棕色(129),黑色(C57/BL6)性別：雄性干細胞更穩(wěn)定

現(xiàn)在是27頁\一共有87頁\編輯于星期二GeneTrap(基因捕獲）源于小鼠干細胞全能性的發(fā)現(xiàn)標示基因高通量小鼠基因組隨機插入，基因分析利用無啟動子標示基因表達框，前端有內(nèi)含子/外顯子剪接信號，后面有PolyA，中間有抗性基因隨機插入內(nèi)含子后會剪接成融合表達蛋白，標示基因表達原基因位點失活公數(shù)據(jù)共平臺庫：InternationalGeneTrapConsortiumiscentralizingdataandcelllinescanberequestedfromthem.

現(xiàn)在是28頁\一共有87頁\編輯于星期二基因定位修飾載體類型簡單基因敲除載體構(gòu)建原理條件性敲除載體構(gòu)建原理點突變顯示基因敲入組織專一基因位點敲入（LacZ,EGFP），研究基因表達廣譜loxp敲入，與調(diào)節(jié)基因Cre結(jié)合，進行組織特異性敲除現(xiàn)在是29頁\一共有87頁\編輯于星期二NEO13TKXX1NEO3132野生型載體重組后基因敲除載體設計原理

現(xiàn)在是30頁\一共有87頁\編輯于星期二NEOTKFRTFRTloxPloxP野生型載體用Flipase去NEOFRTCRE雜交失活基因loxPFRT條件性敲除載體構(gòu)建原理現(xiàn)在是31頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是32頁\一共有87頁\編輯于星期二Genetargetinginembryonicstemcellshasbecometheprincipaltechnologyformanipulationofthemousegenome,offeringunrivalledaccuracyinalleledesignandaccesstoconditionalmutagenesis.Tobringtheseadvantagestothewiderresearchcommunity,large-scalemouseknockoutprogrammesareproducingapermanentresourceoftargetedmutationsinallprotein-codinggenes.Herewereporttheestablishmentofahigh-throughputgene-targetingpipelineforthegenerationofreporter-tagged,conditionalalleles.Computationalalleledesign,96-wellmodularvectorconstructionandhigh-efficiencygene-targetingstrategieshavebeencombinedtomutategenesonanunprecedentedscale.Sofar,morethan12,000vectorsand9,000conditionaltargetedalleleshavebeenproducedinhighlygermline-competentC57BL/6Nembryonicstemcells.High-throughputgenomeengineeringhighlightedbythisstudyisbroadlyapplicabletoratandhumanstemcellsandprovidesafoundationforfuturegenome-wideeffortsaimedatdecipheringthefunctionofallgenesencodedbythemammaliangenome.現(xiàn)在是33頁\一共有87頁\編輯于星期二基因定位修飾過程干細胞分離、培養(yǎng)，多用固定細胞系基因定位修飾載體構(gòu)建干細胞轉(zhuǎn)染和重組克隆篩選干細胞囊胚顯微注射嵌合體產(chǎn)生與傳代雜合體產(chǎn)生純合體產(chǎn)生基因功能的分析現(xiàn)在是34頁\一共有87頁\編輯于星期二利用小鼠干細胞進行基因打靶過程現(xiàn)在是35頁\一共有87頁\編輯于星期二嵌合體的傳代雜交嵌合體（Founders）ES均來源于129鼠系，為棕色(agouti)C57／BL6

囊胚為黑色(black)ES注入后，毛色可以預測干細胞并入比例40-100%雄性嵌合體與C57/BL6母鼠交配6周左右與兩只C57母鼠雜交，每周換一次母鼠棕色為顯性，如果連續(xù)六窩全黑，放棄嵌合鼠現(xiàn)在是36頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是37頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是38頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是39頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是40頁\一共有87頁\編輯于星期二輸卵管移植子宮移植代孕鼠電擊篩選囊胚注射轉(zhuǎn)基因和基因定位修飾過程的比較Founder的產(chǎn)生

傳代，分析受精卵細胞顯微核注射現(xiàn)在是41頁\一共有87頁\編輯于星期二轉(zhuǎn)基因與基因打靶比較轉(zhuǎn)基因基因打靶遺傳特性顯性，穩(wěn)定或不穩(wěn)定，多用于基因過表達隱性或顯性，穩(wěn)定多用于失活基因插入位點隨機，不可控固定位點，可人為控制拷貝數(shù)多變,1to>100雜合1,純合2表達取決于插入位點和啟動子完整性模仿原基因表達模式時間五個月以上九個月以上花費3萬元以上8-10萬美元周圍基因相互影響一般有影響無法預測一般沒有影響可以預測現(xiàn)在是42頁\一共有87頁\編輯于星期二第三部分基因定位修飾進展CRISPR/Cas9技術(shù)原理利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究生理、病理發(fā)育現(xiàn)在是43頁\一共有87頁\編輯于星期二DNA隨機突變（化學誘變，放射線誘變）轉(zhuǎn)基因技術(shù)（DNA片段基因組隨機插入）小鼠全能干細胞發(fā)現(xiàn)和應用（基因捕獲）基因打靶（DNA重組基因定位修飾）鋅指核酸酶ZNF（基因組定位切割修飾）TALEN（基因組定位切割修飾）CRIPSR-Cas9（基因組定位切割修飾）基因組修飾歷史現(xiàn)在是44頁\一共有87頁\編輯于星期二利用ZFN技術(shù)進行基因組修飾2000早期，研究者開發(fā)了鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù),首次利用人工構(gòu)建DNA序列特異核酸酶，對基因組進行識別、切割和修飾鋅指酶發(fā)源于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)，類似于轉(zhuǎn)錄因子，具有兩個結(jié)構(gòu)域：人工設計DNA-bindingzinc-fingerprotein(ZFP)domainFokIDNAnucleasedomainDNA識別域由3-6個Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)組成，每個鋅指蛋白區(qū)結(jié)合3’-5’方向DNA鏈上特異三聯(lián)體堿基以及5’-3’方向的一個堿基ZFN以二聚體結(jié)合到靶位點上，相距5-7個堿基，通過兩個FokI核酸酶切割靶位點由于信息有限，設計復雜，有多達60種的鋅指庫，設計完美的鋅指核酸酶要花費很長時間現(xiàn)在是45頁\一共有87頁\編輯于星期二ZFN工作原理現(xiàn)在是46頁\一共有87頁\編輯于星期二利用TALEN技術(shù)進行基因組修飾Transcriptionactivator-likeeffectornucleases(TALENs)TALENs同樣包括兩個結(jié)構(gòu)域，一個是DNABinding，另一個是FokInucleaseTranscriptionactivator-likeeffectors(TALEs)為33–35aminoacidrepeats,每一個repeat識別一個堿基對，由中間的第12和13氨基酸決定，稱為repeatvariablediresidues(RVDs).最常用的四組為Asn-Asn,Asn-Ile,His-AspandAsn-Gly，分別識別G,A,C和T四個堿基?，F(xiàn)在是47頁\一共有87頁\編輯于星期二TALEN工作原理現(xiàn)在是48頁\一共有87頁\編輯于星期二CRISPR/Cas9發(fā)現(xiàn)與應用進展現(xiàn)在是49頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是50頁\一共有87頁\編輯于星期二最初發(fā)現(xiàn)于bacteriaorarchaea，由protospacers和directrepeat序列順序排列，可以轉(zhuǎn)錄成crRNA和tracrRNA兩種小RNA。Protospacers，DNAfragments(~20bp)，來源于噬菌體或質(zhì)粒，相間于directrepeat，統(tǒng)稱為CRISPR。兩個小RNA與CRISPR-associatedprotein9(Cas9)一起，具有DNA特異序列endonuclease活性，識別和切割外源DNA、RNA，行使免疫保護功能。crRNAandtracrRNA可以通過DNA轉(zhuǎn)錄成single-chainguideRNA(sgRNA)，同樣具有CRISPR功能。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat(CRISPR)現(xiàn)在是51頁\一共有87頁\編輯于星期二CRISPR－Cas9工作原理現(xiàn)在是52頁\一共有87頁\編輯于星期二常用表達系統(tǒng)

AvailableExpressionCassette現(xiàn)在是53頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是54頁\一共有87頁\編輯于星期二常用質(zhì)粒px330現(xiàn)在是55頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是56頁\一共有87頁\編輯于星期二PAM序列出現(xiàn)頻率現(xiàn)在是57頁\一共有87頁\編輯于星期二設計簡單效率高特異性強一次性多位點修飾適用于各種生物用途廣CRISPR－Cas9系統(tǒng)優(yōu)勢現(xiàn)在是58頁\一共有87頁\編輯于星期二CRISPR－Cas9技術(shù)應用現(xiàn)在是59頁\一共有87頁\編輯于星期二Cas9蛋白和導向RNA共轉(zhuǎn)染人細胞基因組修飾1）核定位Cas9蛋白2）U6啟動子帶動的一個或多個導向RNA3）導向RNA緊跟著正確的PAM序列4）任何GN20NGG均可為靶點現(xiàn)在是60頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是61頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是62頁\一共有87頁\編輯于星期二3gene,6locustargetingefficiency現(xiàn)在是63頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是64頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是65頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是66頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是67頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是68頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是69頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是70頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是71頁\一共有87頁\編輯于星期二現(xiàn)在是72頁\一共有87頁\編輯于星期二Nickase工作原理現(xiàn)在是73頁\一共有87頁\編輯于星期二Cas9突變，細菌篩選不同PAM序列增加了特異性發(fā)現(xiàn)更多的Cas9變異型具有更好的特異性發(fā)現(xiàn)更小的Cas9變異型說明還有挖掘潛力和改進的空間現(xiàn)在是74頁\一共有87頁\編輯于星期二Cell.2015Oct22;163(3):759-71.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.Epub2015Sep25.Cpf1IsaSingleRNA-GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR-CasSystem.ZetscheB1,GootenbergJS2,AbudayyehOO3,SlaymakerIM3,MakarovaKS4,EssletzbichlerP3,VolzSE3,JoungJ3,vanderOostJ5,RegevA6,KooninEV4,ZhangF7.AbstractThemicrobialadaptiveimmunesystemCRISPRmediatesdefenseagainstforeigngeneticelementsthroughtwoclassesofRNA-guidednucleaseeffectors.Class1effectorsutilizemulti-proteincomplexes,whereasclass2effectorsrelyonsingle-componenteffectorproteinssuchasthewell-characterizedCas9.Here,wereportcharacterizationofCpf1,aputativeclass2CRISPReffector.WedemonstratethatCpf1mediatesrobustDNAinterferencewithfeaturesdistinctfromCas9.Cpf1isasingleRNA-guidedendonucleaselackingtracrRNA,anditutilizesaT-richprotospacer-adjacentmotif.Moreover,Cpf1cleavesDNAviaastaggeredDNAdouble-strandedbreak.Outof16Cpf1-familyproteins,weidentifiedtwocandidateenzymesfromAcidaminococcusandLachnospiraceae,withefficientgenome-editingactivityinhumancells.IdentifyingthismechanismofinterferencebroadensourunderstandingofCRISPR-Cassystemsandadvancestheirgenomeeditingapplications.現(xiàn)在是75頁\一共有87頁\編輯于星期二FengZhanglab'sTargetFinder?IdentifiesgRNAtargetsequencesfromaninputsequenceandchecksforoff-targetbinding.Currentlysupports:Drosophila,Arabidopsis,zebrafish,C.elegans,mouse,human,rat,rabbit,pig,possum,chicken,dog,mosquito,andstickleback.MichaelBoutroslab'sTargetFinder(E-CRISP)?IdentifiesgRNAtargetsequencesfromaninputsequenceandchecksforoff-targetbinding.Currentlysupports:Drosophila,Arabidopsis,zebrafish,C.elegans,mouse,human,rat,yeast,frog,Brachypodiumdistachyon,Oryzasativa,OryziaslatipesRGENTools:Cas-OFFinder?IdentifiesgRNAtarget