利用SSR標記分析當前4水系中華絨螯蟹天然群體的遺傳特征

利用SSR標記分析當前4水系中華絨螯蟹天然群體的遺傳特征1摘要：利用6對微衛(wèi)星引物對當前長江、遼河、甌江以及萊茵河水系F2代4個中華絨螯蟹天然群體共計80個個體進行群體遺傳學研究。結(jié)果表明：4個中華絨螯蟹群體均具有較高的遺傳多樣性（總體平均期望雜合度He為0.7411），各個群體的平均有效等位基因數(shù)在4.3333?4.500之間。各位點上的觀察雜合度（Ho）均高于期望雜合度（He），其中長江群體、遼河群體、甌江群體和以及萊茵河F2代群體的平均觀察雜合度分別為0.9167、0.9584、0.9306、0.7995，平均期望雜合度分別為0.7496、0.7416、0.7585、0.7149。其中甌江群體的平均期望雜合度最高（平均He為0.7585）,萊茵河F2代群體最低（平均He為0.7149）,各群體間無顯著性差異（P>0.05）。本研究中各中華絨螯蟹群體在6個微衛(wèi)星位點上的固定指數(shù)Fis均為負值，其中遼河群體的Fis最?。?0.3485）,萊茵河F2代的Fis最大（-0.1669）,提示各中華絨螯蟹天然群體內(nèi)部均存在著較為明顯的遠緣繁殖現(xiàn)象。本研究中各中華絨螯蟹天然群體間的遺傳距離介于0.0688至0.1743之間，其中長江群體與遼河群體間的遺傳距離最?。?.0688），甌江群體與萊茵河水系F2代群體間的遺傳距離最大（0.1743）。本研究中4個群體間的平均基因流Nm均大于1,其中長江群體與遼河群體、萊茵河水系F2間的Nm較大（分別為20.3629和14.3851）,遺傳分化指數(shù)Fst較小（分別為0.0121和0.0171）。聚類分析結(jié)果顯示，長江群體與遼河群體首先聚為一支后，然后與萊茵河F2群體相聚，而甌江群體單獨聚為一支。AMOVA分析結(jié)果表明，本研究中各群體間的基因交流比較頻繁（總體Nm為5.943），群體間的遺傳分化較?。傮wFst為0.0403），其中大部分遺傳變異存在于中華絨螯蟹各群體內(nèi)部（95.96%）,存在于群體間的遺傳變異較少（4.04%）（PV0.05）,結(jié)果提示當前各水系中華絨螯蟹的種質(zhì)混雜情況已較為嚴重。關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹；微衛(wèi)星；種質(zhì)混雜.中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）俗稱河蟹，主要分布于中國長江、遼河、甌江等水域,但群體自然分布以長江流域為主。與甌江、遼河等水系所產(chǎn)河蟹相比，長江水系中華絨螯蟹在生長性能及肉質(zhì)品質(zhì)上具有明顯優(yōu)勢，深受消費者青睞。自上世紀60年代發(fā)現(xiàn)長江口大眼幼體為中華絨螯蟹蟹苗以來至80年代初期，在我國北起內(nèi)蒙、遼寧，南至珠江口，西至新疆博斯騰湖都進行了長江水系中華絨螯蟹的人工增殖放流活動，推動了我國中華絨螯蟹蟹增殖業(yè)的迅猛發(fā)展［1］。由于對長江口天然蟹苗的酷捕濫撈、江湖建閘以及水質(zhì)污染等原因，從1982年起長江中華絨螯蟹天然蟹苗資源開始驟然衰退。在這種情況下，1984年起遼河水系、甌江水系的蟹苗開始被大量開發(fā)利用，在一段時間內(nèi)幾乎占領(lǐng)了整個河蟹增養(yǎng)殖市場［2］。自20世紀70年代末突破中華絨螯蟹人工育苗技術(shù)難關(guān)以來，由于天然苗種產(chǎn)量越來越少，越來越多的苗種開始來源于人工養(yǎng)殖群體。20世紀90年代以來，河蟹人工培苗技術(shù)已十分成熟，許多育苗單位為了降低成本，普遍選用小規(guī)格中華絨螯蟹用于苗種繁育，甚至無序引進外水系親蟹和蟹苗用于苗種生產(chǎn)。不同水系群體的頻繁引種和培育苗種的盲目放流，以及人工養(yǎng)殖群體向自然水體的逃逸，打破了各水系中華絨螯蟹的天然分布格局，加劇了各水系天然水域中華絨螯蟹的種質(zhì)混雜程度［3-4］。近年來，許多科研單位已針對中華絨螯蟹種質(zhì)特征已開展了許多研究工作?？傮w而言，這些研究多側(cè)重分析不同水系間中華絨螯蟹的生物學特性［5-6］，尋找區(qū)分不同水系群體的特異遺傳標記［7-9］，研究各水系中華絨螯蟹的遺傳多樣性指數(shù)以及系統(tǒng)發(fā)育等方面［10-15］，目前尚未見對當前不同水系中華絨螯蟹天然群體間基因交流和種質(zhì)混雜的研究報道。在當前各水系中華絨螯蟹種群交流非常頻繁的情況下，本研究采用微衛(wèi)星技術(shù)研究了當前各水系中華絨螯蟹天然群體的遺傳差異，分析了不同群體間的遺傳結(jié)構(gòu)和基因交流情況，旨在為后續(xù)中華絨螯蟹種質(zhì)資源保護與合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料長江、遼河以及甌江水系中華絨螯蟹天然苗種分別采自江蘇長江南京段、遼寧省遼河遼陽段、浙江省甌江溫州段，萊茵河水系中華絨螯蟹F2代取自江蘇高淳國家級中華絨螯蟹原良種場（圖1）。采樣時間為2009年3月28日至6月8日，每個群體采樣量均大于200只，樣品鑒定參照GB/T19783-2005進行，樣品均活體運輸至實驗室后-20°C冷凍保存?zhèn)溆谩D1中華絨螯蟹4群體采樣地點Fig.1Samplingsitesofthe4Eriocheirsinensisstocks1.2微衛(wèi)星引物選取HanflingBM］報道的6對微衛(wèi)星引物序列用于各群體中華絨螯蟹的群體遺傳學研究，引物由上海英駿生物公司合成，引物序列、PCR反應(yīng)條件、擴增產(chǎn)物長度等信息見表1。表16個中華絨螯蟹微衛(wèi)星位點的特征Tab.1Characterizationof6microsatelliteslociofE.sinensis微衛(wèi)星位點引物退火溫度PCR產(chǎn)物長度LocusPrimerAnnealingtemperatureLengthofPCRproductsES18F:CACCGTAAGGTTCCGTAAR:AAGCACCCATAAGTCAATGTA58C170-225ES06F:CCCTTCCATTATCTTAACCTGR:CTGTGCTTCGTCTGTGTATG58C105-180ES67F:TTTGGGATTCACCTTGTCAACTTR:CGACGCACGACAGAGGAGAGG53C105-170ES74F:ACAGCAAGTGGCAACAGGTAAACR:CCGCCCAGCCTCCCGTCAAC58C105-195ES36F:GAGCGAGTATGCAAATGAGTAATR:TTCATTCACGAACAAAACACTAA50C227-430ES87F:CGGAGTGTTTTGTTTGTCR:ATCATCAGCAGCAACCAC55C134-1891.3方法1.3?1DNA模板制備隨機從長江群體、遼河群體、甌江群體及萊茵河水系F2代群體中抽取20只用于微衛(wèi)星分析，采用常規(guī)的酚-氯仿法提取基因組DNA,1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，紫外分光光度法檢測樣品DNA濃度及純度，雙蒸水稀釋至50卩g/mL后備用。PCR擴增與SSR引物篩選PCR擴增在BiometraPCR儀上進行，PCR反應(yīng)體系(TAKARA)為25卩L，其中包括：10xbuffer2.5pL，Mg2+(2.5mmol/L)5pL，dNTP(2.5mmol/L)2pL,正反向引物(10pmol/L)各1卩L,Taq酶0.5U,最后加ddH2O補足體積至25卩L。PCR反應(yīng)共計30個循環(huán)，循環(huán)前96°C預(yù)變性3min,每個循環(huán)包括94°C變性1min，退火1min，72°C延伸1min,循環(huán)結(jié)束后于72C延伸10min,擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測以確定擴增效果。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物通過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色檢驗其多態(tài)性。制備8%變性聚丙烯酰胺凝膠，以20W恒定功率電泳60~120min。電泳完畢后，取下凝膠放入固定液(10%冰乙酸+10%乙醇)中固定30min,雙蒸水漂洗后轉(zhuǎn)移至0.1%的AgNO3溶液中染色30min,雙蒸水漂洗后放入顯色液(3.0%NaOH，5mL甲醛)中待條帶充分顯現(xiàn)后對電泳圖譜拍照后分析。1.3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析根據(jù)每個個體產(chǎn)生的條帶位置確定其基因型，用Popgen軟件分析微衛(wèi)星位點的有效等位基因數(shù)(Ne)、基因觀測雜合度(Ho)、基因期望雜合度(He)、群體間遺傳相似系數(shù)(I)以及遺傳距離(Ds)、群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)等指標，采用固定指數(shù)Fis評估種群內(nèi)個體間的近交程度：Fis=1-Ho/He，采用GenAlEx6.2軟件對群體內(nèi)及群體間的分子變異(AMOVA)情況進行分析。2.結(jié)果與分析2.1各基因位點的遺傳多態(tài)性表24個群體中華絨螯蟹在6個微衛(wèi)星位點上的遺傳多態(tài)性Tab.2PolymorphicoffourstocksofE.sinensisthe6microsatelliteloci位點參數(shù)長江群體遼河群體甌江群體萊茵河F2locusParameters(CJ)(LH)(OJ)(LYHF2)Ne4.29854.50004.43083.1648He0.80070.81160.80800.5324ES06Ho1.00001.00001.00000.7138Fis-0.3032-0.2857-0.2915-0.3401Ne3.84003.60003.31033.2360He0.77170.75360.72830.7210ES18Ho1.00001.00001.00001.0000Fis-0.3521-0.3846-0.4328-0.4472Ne3.38824.50003.31035.2364He0.73550.81160.72830.8442ES36Ho0.75000.91670.91670.6667Fis-0.0640-0.1786-0.31340.1760Ne3.55562.93883.89193.0638He0.75000.68840.77540.7029ES67Ho0.91671.00000.91670.9167Fis-0.2754-0.5158-0.2336-0.3608Ne4.72133.03164.29853.7403He0.72250.69930.80070.7645ES74Ho1.00000.91670.91670.7500Fis-0.2687-0.3679-0.1946-0.0237Ne3.20002.90913.13043.2727He0.71740.68480.71010.7246ES87Ho0.83330.91670.83330.7500D0.16160.33860.17350.0351Fis-0.2121-0.3968-0.2245-0.0800Ne4.33334.50004.50004.5000MEANHe0.74960.74160.75850.7149Ho0.91670.95840.93060.7995本研究利用6對微衛(wèi)星引物對4個天然群體共80個個體進行PCR擴增，結(jié)果表明（表1），本研究中所涉及的4個中華絨螯蟹群體均具有較高的遺傳多樣性（總體平均He為0.7411）。4個群體的平均有效等位基因數(shù)在4.3333?4.500之間。各位點上的觀察雜合度（Ho）均高于期望雜合度（He）,其中長江群體、遼河群體、甌江群體和以及萊茵河F2代群體的平均觀察雜合度分別為0.9167、0.9584、0.9306、0.7995，平均期望雜合度分別為0.7496、0.7416、0.7585、0.7149。其中甌江群體的平均期望雜合度最高（平均He為0.7585），萊茵河F2代群體最低（平均He為0.7149），各群體間無顯著性差異（P>0.05）。采用固定指數(shù)Fis來評估各中華絨螯蟹群體內(nèi)個體間的近交情況。結(jié)果顯示，本研究中各中華絨螯蟹群體在6個微衛(wèi)星位點上的固定指數(shù)Fis均為負值，其中遼河群體的平均Fis值最小，為-0.3485，萊茵河F2代的平均Fis值最大，為-0.1669。2.2各群體間的遺傳分化本研究中各中華絨螯蟹天然群體間的遺傳距離介于0.0688至0.1743之間（表3），其中長江群體與遼河群體間的遺傳距離最?。?.0688）,甌江群體與萊茵河水系F2代群體間的遺傳距離最大（0.1743）。本研究中各群體間的平均基因流Nm均大于1,其中長江群體與遼河群體間的Nm最大（20.3629），遺傳分化指數(shù)Fst最小（0.0121）；甌江群體與萊茵河F2代之間的基因流Nm最?。?.7421），遺傳分化指數(shù)Fst最大（0.0313）?？傮w而言，本研究中各群體間的基因交流比較頻繁，各群體間的遺傳分化較小。表3中華絨螯蟹4個群體間的遺傳距離（Qs）\遺傳相似度⑺及基因流（麗）（對角線下）譴傳分化系數(shù)(Fst)(對角線上)Tab.3Geneticdistances(Ds),geneticsimilarityindices(I)(belowdiagonal),geneflow(Nm)andgeneticdfrentiationcoeficient(Fst)(abovediagonal)amongfOurstocksofE.sinensis群體PopulationsCJLHOJLYHCJ****20.3629/0.01218.3792/0.029014.3851/0.0171LH0.0688/0.9335****8.2252/0.02958.5274/0.0285OJ0.1679/0.84540.1684/0.8450****7.7421/0.0313LYH0.0951/0.90930.1636/0.84910.1743/0.8401****I 長江群體 遼河群體—— 萊茵河咼群體 甌江群體' 0^005 '圖2基于NeZ'遺傳距離構(gòu)建的4個群體的UPGMA樹Fig.2UPGMAtreeoffourE.sinensisstocksbasedonNei'sgeneticdistance基于Nei氏遺傳距離，用UPGMA法對4個中華絨螯蟹天然群體進行聚類分析（圖1）。結(jié)果表明，長江群體與遼河群體首先聚為一支，然后與萊茵河F2群體相聚，而甌江群體單獨聚為一支。表4中華絨螯蟹4個野生群體的分子變異分析（AMOVA）Tab.4AMOVAresultsof4E.sinensisstocks變異來源自由度df平方和SS變異組分Va變異貢獻率（%）總遺傳分化Fst顯著性檢驗P*群體間群體內(nèi)315.7920.1474.040.04030.02076153.9173.49895.96/總和79169.7083.645100//*P值表示比觀察值變異大的概率。*P-valuesaretheprobabilitiesofhavingamoreextremevariancecomponentthantheobservedvaluesalone.將本研究中3個群體作為一組進行分子變異分析（AMOVA分析），分別計算群體內(nèi)及群體間遺傳變異對總遺傳變異的貢獻率（表4）。結(jié)果表明，本研究4個群體間的基因流較大，遺傳分化較小（總體Fst為0.0403），其中大部分遺傳變異95.96%）存在于各中華絨螯蟹群體內(nèi)部，存在于群體間的遺傳變異較少（4.04%）（PV0.05）。3.討論3.1各水系中華絨螯蟹的遺傳多樣性生物的遺傳多樣性是生命進化和物種分化的基礎(chǔ)，在一定程度上決定了該物種在自然或人為條件下對環(huán)境改變的適應(yīng)能力［17］。研究發(fā)現(xiàn)，無論在物種水平，還是在群體水平，本研究中各中華絨螯蟹群體均具有較高的遺傳多樣性，這與Chang［14］、MaHaitao［15以及潘建林等［18］用微衛(wèi)星技術(shù)對中華絨螯蟹所進行的研究結(jié)果是一致的。分析其原因可能是，多年來不同水系中華絨螯蟹存在著頻繁的群體交流，這種交流一方面加劇了各水系中華絨螯蟹的種質(zhì)混雜，同時也在一定程度上“提高”了當前各水系中華絨螯蟹的遺傳多樣性。本研究中萊茵河F2代群體的遺傳多樣性指數(shù)最低，其原因可能是由于該群體從萊茵河水系引入國內(nèi)的時間較短，其受相近群體“基因污染”的可能性較??；同時，該群體為中華絨螯蟹移居海外后所形成群體的后代，可能由于“奠基者效應(yīng)”而降低了其遺傳多樣性指數(shù)。3.2各水系中華絨螯蟹群體的遺傳結(jié)構(gòu)對幾個中華絨螯蟹天然群體間的遺傳距離進行分析可知，長江群體與遼河群體間的遺傳距離較小，與甌江群體間的遺傳距離較大。本研究各群體間均存在著較高水平的基因交流（Nm值均大于6）。其中長江群體與遼河群體間的基因流最大（20.3629）,由此推測長江群體與遼河群體間的種質(zhì)混雜更為嚴重。上世紀60年代發(fā)現(xiàn)長江口大眼幼體為中華絨螯蟹蟹苗以來，在包括遼河地區(qū)在內(nèi)的全國均進行了長江水系中華絨螯蟹的人工增殖放流活動，人為導致了長江、遼河等水系中華絨螯蟹群種群間的基因交流。上世紀80年代，由于長江水系中華絨螯蟹苗種資源銳減，遼河水系中華絨螯蟹苗種于1984年起開始被大量引入南方，至此長江、遼河水系中華絨螯蟹群體間的基因交流已十分頻繁。上世紀90年代以來，遼河等北方地區(qū)的河蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展非常迅速，由于目前遼河水系及丹東至大連沿岸水域已沒有具有利用價值的苗汛，相當一部分的種源來自長江流域等南方地區(qū)。由于河蟹養(yǎng)殖過程中的逃逸現(xiàn)象較為普遍，推測由此加劇了遼河地區(qū)中華絨螯蟹天然群體的種質(zhì)混雜程度。本研究中甌江群體與其它幾個群體間的遺傳距離相對較遠，遺傳分化相對較大，在UPGMA樹上也單獨聚為一支。喬新美等對長江、甌江中華絨螯蟹LDH、MDH、EST等3種同工酶進行研究時曾發(fā)現(xiàn)，3種同工酶在長江與甌江群體的心臟、卵巢等組織中具有較為明顯的差異［19］。孫紅英等采用16SrDNA對中國大陸絨螯蟹進行系統(tǒng)分化研究時曾在甌江水系野生群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)合浦絨螯蟹所特有的單元型，認為甌江是中華絨螯蟹與合浦絨螯蟹兩個亞種在地理分布上的過渡地帶［20］。由于本研究未同時采集合浦絨螯蟹樣本進行分析，因此不能確定甌江群體是否已與合浦絨螯蟹群體發(fā)生種質(zhì)混雜。李思發(fā)等利用RAPD技術(shù)對來自歐洲的中華絨螯蟹群體與長江水系中華絨螯蟹群體進行了遺傳分析，認為“移居”到歐美的中華絨螯蟹來源于中國的長江水系［21］。王武等比較了萊茵河水系與長江水系中華絨螯蟹的外部特征，通過聚類分析將長江蟹與萊茵蟹劃為一組⑸。因此，本研究選取的萊茵河水系F2代群體與長江、遼河以及甌江群體進行比較研究，研究中發(fā)現(xiàn)，長江群體與萊茵河F2代群體間的遺傳距離較小，遺傳相似度較高，結(jié)合兩個群體間遺傳分化及聚類分析結(jié)果，本研究傾向于支持李思發(fā)等人的結(jié)論，認為萊茵河水系群體與中華絨螯蟹長江群體之間存在較為密切的親緣關(guān)系。固定指數(shù)Fis常用來表示群體內(nèi)個體間的近交系數(shù)。當群體內(nèi)觀測雜合度小于期望雜合度，同時Fis為正值時，表明群體內(nèi)近交程度較嚴重；女口Fis為負值，同時群體內(nèi)觀測雜合度大于期望雜合度，則表示群體內(nèi)存在遠緣繁殖［17］。本研究中各群體Fis值均為負值，表明本研究所涉及的各中華絨螯蟹天然群體內(nèi)部均存在著較多的遠緣繁殖。分析其原因，可能由于多年來我國各水系中華絨螯蟹無序引種，各水系相應(yīng)種群間產(chǎn)生了較為頻繁的基因交流，從而在各群體內(nèi)產(chǎn)生了較為明顯的遠緣繁殖現(xiàn)象。3.3展望各水系中華絨螯蟹種質(zhì)資源的形成，是生物界長期選擇和適應(yīng)的結(jié)果。自上世紀90年代以來，已有許多科研工作者從表型［5-7,9］、染色體水平［22］、蛋白質(zhì)水平［8,19］及DNA水平［23-25］等層次，對不同水系中華絨螯蟹的種質(zhì)特征進行了分析研究。這些研究多側(cè)重于分析不同水系中華絨螯蟹的生物學特性、尋找區(qū)分不同水系群體的特異遺傳標記，以及研究中華絨螯蟹的系統(tǒng)發(fā)育等方面，而對當前不同水系中華絨螯蟹群體間的基因交流及遺傳分化研究較少。從理論上講，在不能準確提供上世紀60年代以前各水系中華絨螯蟹樣本的情況下，僅利用當前各水系中華絨螯蟹樣本所做的遺傳特征以及系統(tǒng)發(fā)生分析，均不能真實反映各水系中華絨螯蟹在進化歷史上所處的地位。在當前中華絨螯蟹種質(zhì)資源混雜已成事實的情況下，應(yīng)采用多種手段深入研究當前各水系中華絨螯蟹群體內(nèi)及群體間的遺傳差異，分析不同水系中華絨螯蟹群體間的遺傳結(jié)構(gòu)和基因交流情況，評估當前各水系中華絨螯蟹的種質(zhì)混雜情況，從而為后期長江水系中華絨螯蟹良種選育工作積累資料。參考文獻：王成輝，李思發(fā).中華絨螯蟹種質(zhì)研究進展[J].中國水產(chǎn)科學,2002,9(1):92-96.趙乃剛.長江中華絨螯蟹種質(zhì)資源混雜對養(yǎng)蟹業(yè)的影響[J].內(nèi)陸水產(chǎn),1998,5:2-4.谷孝明，趙福順.長江中華絨螯蟹的資源與養(yǎng)殖現(xiàn)狀及其種質(zhì)保護[J].湖泊科學,2001,13(3):267-271.陳藍蓀,王武,陳再忠.從河蟹市場分析看中華絨螯蟹養(yǎng)殖的發(fā)展方向[J].上海水產(chǎn)大學學報,2001,10(1):81-85.王武，張文博，邊文冀，陸全平，姚堯.絨螯蟹三個種群形態(tài)判別比較[J].水產(chǎn)科技情報,2005,32(2):81-83.許加武，任明榮，李思發(fā).長江、遼河、甌江中華絨螯蟹種群的形態(tài)判別[J]?水產(chǎn)學報,1997,21(3):269-274.李勇，李思發(fā)，王成輝，等.三水系中華絨螯蟹形態(tài)判別程序的建立和使用[J].水產(chǎn)學報,2001,25(2):120-126.趙金良，李思發(fā).中國大陸沿海六水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體親緣關(guān)系:生化遺傳差異分析[J].水產(chǎn)學報，1999,23(4):331-335.李晨虹，李思發(fā).中國大陸沿海六水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體親緣關(guān)系:形態(tài)判別分析[J].水產(chǎn)學報,1999,23(4):337-342.TangBP，KYZhou，DXSong，etal.MolecularsystematicsoftheAsianmittencrabs，genusEriocheir(Crustacea:Brachyura)[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2003，29(2):309-316.謝浩，陸仁后，項超美，等.利用RAPD技術(shù)對三種絨螯蟹親緣關(guān)系的研究[J].水生生物學報，1999，23(2):120-125.邱濤，陸仁后，項超美，等.RAPD方法對中華絨螯蟹長江、遼河、甌江群體的遺傳多樣性研究[J].淡水漁業(yè),1997,27(5):1-4.高志千，周開亞.中華絨螯蟹遺傳變異的RAPD分析[J].生物多樣性,1998,6(3):186-190.ChangYM，LiQl，MaHT.MicrosatelliteanalysisofgeneticdiversityandpopulationstructureofChineseMittenCrab(Eriocheirsinensis)[J].J.Genet.Genomics.2008，35:171-176.MaHT，ChangYM，etal.Microsatelliteva