激光掃描共聚焦顯微鏡技術

激光掃描共聚焦顯微鏡技術第1頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一LaserScanningConfocalMicroscope第2頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一使用熒光物質(zhì)標記細胞中的特定成分或結(jié)構，不僅圖像與對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61λ/NA）。但當所觀察的熒光標本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學標本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構）。1、普通熒光顯微鏡的不足第3頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1水銀弧光燈2中密度濾片3光鑭4場鑭5激發(fā)濾片6分光鏡（BSP)7物鏡8樣品9,10發(fā)射濾片11目鏡Basicsofconventionalfluorescencemicroscope第4頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragm-光圈Ocular-目鏡ExcitationFilter第5頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一ConfocalPrincipleObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilter第6頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一Differencesbetweenconventionalandconfocalmicroscope1122觀察的熒光標本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學標本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構）。第7頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一共聚焦顯微鏡一次只有樣品的小部分區(qū)域被照明，而普通熒光顯微鏡則有更寬的區(qū)域被照明。第8頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第9頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第10頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第11頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一2、共焦顯微鏡發(fā)展歷史

1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦顯微鏡技術的某些基本原理，獲得了美國的專利1967年，Egger和Petran成功地應用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個光學橫斷面1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線性關系和激光掃描器的拉曼光譜學第12頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1984年，Biorad為公司推出了世界第一臺商品化的共聚焦顯微鏡，型號為SOM-100，掃描方式為臺階式掃描1986年MRC-500型改進為光束掃描，用作生物熒光顯微鏡的共聚焦系統(tǒng)1987年White和Amos在英國《自然》雜志發(fā)表了“共聚焦顯微鏡時代的到來”一文，標志著LSCM已成為進行科學研究的重要工具第13頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3、顯微鏡成像清晰度的決定因素:

1）.分辨率

2）.球差

3）.色差第14頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1）、分辨率：

指顯微鏡能將近鄰的兩個質(zhì)點分辨清楚的能力,通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點間的距離來表示。第15頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一人眼及各類顯微鏡的分辨率人眼分辨率：0.20mm光學顯微鏡分辨率：0.25mm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm電子顯微鏡分辨率：0.20nm第16頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一2）、球差：

是由于透鏡不能把近軸光線和遠軸光線在光軸上共聚焦，以至透過標本一點的光線，在通過透鏡時不能聚焦成一點,而是形成一個光斑,從而使成像模糊不清。第17頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3）、色差：

是由于顯微鏡透鏡類似于三棱鏡,對不同顏色的光線具有不同的折射率。所以光線透過透鏡后,不同色的光聚焦在不同點上,從而使成像模糊,而且像的邊緣尚帶有色暈。第18頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第19頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一4、激光掃描共聚焦顯微鏡基本結(jié)構

激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號處理器、計算機以及圖像輸出設備等第20頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一激光共聚焦顯微鏡構成激光器光電倍增管檢測器顯微鏡步進器計算機電子圖像軟件第21頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第22頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1234554第23頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（1）掃描模塊

掃描模塊主要由針孔光欄（控制光學切片的厚度）、分光鏡（按波長改變光線傳播方向）、發(fā)射熒光分色器（選擇一定波長范圍的光進行檢測）、檢測器（光電倍增管）組成。熒光樣品中的混合熒光進入掃描器，經(jīng)過檢測針孔光欄、分光鏡和分色器選擇后，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進行檢測并形成相應的共焦圖象，同時在計算機屏幕上可以顯示幾個并列的單色熒光圖象及其合成圖象第24頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（2）熒光顯微鏡系統(tǒng)

顯微鏡是LSCM的主要組件，它關系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠光學系統(tǒng)可方便地在其中插人光學選件而不影響成像質(zhì)量和測量精度。物鏡應選取大數(shù)值孔徑平場復消色差物鏡，有利于熒光的采集和成像的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺的移動調(diào)節(jié)，焦平面的記憶鎖定都應由計算機自動控制

第25頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但又有其特點：需與掃描器連接，使激光能進入顯微鏡物鏡照射樣品，并使樣品發(fā)射的熒光到達檢測器；需有光路轉(zhuǎn)換裝置，即汞燈與激光轉(zhuǎn)換，同時汞燈光線強度可調(diào)第26頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一（3）常用激光器

激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)，常用的激光器包括以下三種類型:半導體激光器：405nm（近紫外譜線氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（藍綠光)氦氖激光器：543nm（綠光-氦氖綠激光器）633nm（紅光—氦氖紅激光器)第27頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一UV激光器（紫外激光器）：351nm、364nm（紫外光)風冷、水冷冷卻系統(tǒng)及穩(wěn)壓電源4）輔助設備

第28頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發(fā)射的一定波長的激發(fā)光，光線經(jīng)放大后通過掃描器內(nèi)的照明針孔光欄形成點光源，由物鏡聚焦于樣品的焦平面上，樣品上相應的被照射點受激發(fā)而發(fā)射出的熒光，通過檢測孔光欄后，到達檢測器，并成像于計算機監(jiān)視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點的熒光圖像組成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片基本工作原理第29頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一

從某種意義上講，共聚焦顯微鏡是一種現(xiàn)代化的光學顯微鏡，它對傳統(tǒng)的光鏡從以下幾方面作了改進

第30頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一

1）、光源

用激光做光源，從理論上消除了色差。因為激光的單色性強、光源波束集中、波長相同。

2）、采用了共扼聚焦技術

在物鏡的焦平面上放置了一個小孔，將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差。

第31頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一共扼聚焦原理圖第32頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一激光器擴光器樣品濾光片針孔檢測器入射光發(fā)射光長通濾光片第33頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一入射光發(fā)射光長通濾光片激光器擴光器樣品濾光片針孔檢測器第34頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一入射光發(fā)射光長通濾光片激光器擴光器樣品濾光片針孔檢測器第35頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一

普通光學顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別第36頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3）、點與面掃描技術

共聚焦顯微鏡：將樣品分解成二維或三維空間上的無數(shù)點，用十分細小的激光束（點光源）逐點逐行掃瞄、成像，通過計算機軟件組合，最后得到一個整體平面的或立體的像。

普通光鏡：是在可見光源下一次性成像。第37頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第38頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一Z

通過精細平面光切，形成生物樣品不同平面的精細圖象，將一個連續(xù)的光切圖象Z軸重疊就可形成一個完整的三維圖象第39頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第40頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第41頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第42頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第43頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一4）、圖像信號及處理：

光電倍增管放大信號，計算機采集和處理光信號。

計算機代替了人眼或照相機進行觀察、攝像，得到的圖象是數(shù)字化的，可以在電腦中進行處理，再一次提高圖象的清晰度。第44頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一5、共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1）.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像第45頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一2）.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片conventionalconfocal第46頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一3）.增加側(cè)向分辨率

第47頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一4）.由于點對點掃描去除了雜散光的影響

第48頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1）.點照明2）.具有照明pinhole和探測pinhole3）.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面4）.具有掃描系統(tǒng)——逐點掃描成像5）.具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標記物6、激光掃描共焦顯微鏡的設計特點第49頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一1）.xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x

傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2）.樣品的最大厚度:

取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度

Z軸的最大移動范圍(166m、Z-wide)3）.樣品的最小光切厚度:(載物臺最小移動距離為40nm）取決于:物鏡的NA、針孔大小

Z軸的最小移動步距:40nm Z軸的分辨率:0.35m

7、技術指標（LeicaTCSSP2):

第50頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一4）.激光器

Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm

激光器的特點:1)方向性好:激光基本延直線傳播

2)單色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度 集中的。

4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合第51頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一5）.四個熒光通道,一個透射光通道

即除了可同時采集多標記熒光圖像外 還可以同時采集透射光圖像,但透射光 圖像為非共焦圖像。第52頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一6）.掃描速度:slow220lines/s5125122-3秒

slow2440lines/s（2：雙向掃描）

medium450lines/s5125121.7秒

medium2900lines/sfast1000lines/s

5125120.7秒

1281280.2秒

fast22000lines/s7）.掃描密度:

646412812851251210241024

20482048第53頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一8.共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。第54頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一ConfocalPrinciple小孔光圈第55頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一共聚焦掃描顯微鏡的成像原理激光作為光源采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。掃描方式成像激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。光點共聚焦

光源和探測器前方都各有一個針孔（照明針孔和探測針孔）。直徑約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。第56頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一ConfocalPrinciple照明針孔探測針孔二色鏡或分光鏡激光光源第57頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第58頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一第59頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。第60頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光、近紅外）照明方式：點照明、逐點掃描成像方式：共聚焦、逐點成像輸出：實時觀測,數(shù)字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察LSCM的基本特點第61頁，共69頁，2023年，2月20日，星期一

共聚焦顯微鏡真正的威力是依賴于其強烈抑制焦平面外熒光信號的能力，有很