分子標(biāo)記輔助育種MAS

分子標(biāo)記輔助選擇MolecularMarker-AssistedSelectionMAS劉龍博、李潔、張杰分子標(biāo)記輔助育種MAS目錄一、簡介二、應(yīng)用實(shí)例分子標(biāo)記輔助育種MAS一、簡介：

分子標(biāo)記輔助選擇(MolecularMarker-AssistedSelectionMAS)是利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行間接選擇,是對目標(biāo)性狀在DNA水平的選擇,不受環(huán)境影響,不受等位基因顯隱性關(guān)系干擾,選擇結(jié)果可靠,同時(shí)又可避免等位基因間顯隱性關(guān)系的干擾,從而達(dá)到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良;標(biāo)記輔助育種具有標(biāo)記基因型鑒定可以在低世代和植株生長的任何階段進(jìn)行、共顯性的分子標(biāo)記允許在雜合體階段進(jìn)行鑒定隱性基因、對目的基因的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記輔助育種它是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物改良的一種手段。其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離的分子標(biāo)記對選擇個體進(jìn)行目標(biāo)以及全基因組篩選,從而減少連鎖累贅,獲得期望的個體,達(dá)到提高育種效率的目的。分子標(biāo)記輔助育種MAS

分子標(biāo)記輔助選擇是分子標(biāo)記技術(shù)用于作物改良的重要領(lǐng)域,是傳統(tǒng)育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。

分子標(biāo)記（DNA標(biāo)記）：能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。分子標(biāo)記的類型：基于DNA-DNA雜交的分子標(biāo)記，如RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,即限制性長度片段多態(tài)性）?；赑CR的分子標(biāo)記，RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA，即隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)）限制性酶切和PCR結(jié)合的分子標(biāo)記，AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)）基于DNA序列和芯片的分子標(biāo)記，如SNP（Singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性）。分子標(biāo)記輔助育種MAS分子標(biāo)記輔助選擇的優(yōu)越性：可以在植物發(fā)育的任何階段進(jìn)行選擇,對目標(biāo)性狀的選擇不受基因表達(dá)和環(huán)境的影響,可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確的選擇,加速育種進(jìn)程,提高育種效率;共顯性標(biāo)記可區(qū)分純合體和雜合體,不需下代再鑒定,而且在分離世代能快速準(zhǔn)確地鑒定植株的基因型。可有效地對抗病性、抗逆性和根部性狀等表型鑒定困難的性狀進(jìn)行基因型鑒定。在育種項(xiàng)目的初期,育種材料較少,不允許做重復(fù)鑒定,或要冒一定風(fēng)險(xiǎn)。利用分子標(biāo)記技術(shù)則可克服基因型鑒定的困難?？删酆隙鄠€有利基因提高育種效率?？朔涣夹誀钸B鎖,有利于導(dǎo)入遠(yuǎn)緣優(yōu)良基因。分子標(biāo)記輔助育種MAS

影響分子標(biāo)記輔助選擇的主要因素：①標(biāo)記與連鎖基因間的連鎖程度?；亟贿x擇程序中的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可分為前景選擇(foregroundselection)和背景選擇(back-groundselection)。前景選擇是在對回交群體的選擇中,通過對轉(zhuǎn)入受體中的與供體優(yōu)良基因座位緊密連鎖的標(biāo)記或基因內(nèi)標(biāo)記的檢測,從而篩選出攜帶目標(biāo)基因的單株。前景選擇的準(zhǔn)確性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖強(qiáng)度,標(biāo)記與基因連鎖得愈緊密,依據(jù)標(biāo)記進(jìn)行選擇的可靠性就愈高。②性狀的遺傳率。性狀的遺傳率極大地影響MAS選擇效率。遺傳率較高的性狀,根據(jù)表型就可對其實(shí)施選擇,此時(shí)分子標(biāo)記提供的信息量較少,MAS效率隨性狀遺傳率增加而顯著降低。在群體大小有限的情況下,低遺傳率的性狀,進(jìn)行MAS的相對效率較高,但存在一個最適的群體大小,在此限之下MAS效率會降低。分子標(biāo)記輔助育種MAS群體大小。群體大小是制約MAS選擇效率的重要因素之一。一般情況下,MAS群體大小不應(yīng)小于200個。選擇效率隨著群體增加而提高,特別是在低世代,遺傳率較低的情況下尤為明顯。選用分子標(biāo)記數(shù)目。理論上標(biāo)記數(shù)越多,從中篩選出對目標(biāo)性狀有顯著效應(yīng)標(biāo)記機(jī)會就越大,因而應(yīng)有利于MAS。事實(shí)上,MAS效率隨標(biāo)記數(shù)增加先增后減。MAS效率主要取決于對目標(biāo)性狀有顯著效應(yīng)的標(biāo)記,因而選擇時(shí)所用標(biāo)記數(shù)并非越多越好。世代的影響。對基因組中除了目的基因之外的其它部分的選擇,即背景選擇。背景選擇目標(biāo)之一是減少目標(biāo)等位基因載體染色體上供體基因組的比例;目標(biāo)之二是減少非目標(biāo)等位基因載體染色體上的供體基因組。背景選擇盡可能覆蓋整個基因組,進(jìn)行全基因組的選擇。在早代變異方差大,重組個體多,中選幾率大。因此背景選擇應(yīng)在育種早期世代進(jìn)行,隨著世代的增加,背景選擇效率會逐漸下降。分子標(biāo)記輔助育種MAS⑥控制性狀基因數(shù)目。模擬研究發(fā)現(xiàn),隨著QTL（數(shù)量性狀基因座，它指的是控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置）增加,MAS效率降低。當(dāng)目標(biāo)性狀由少數(shù)幾個基因(1~3)控制時(shí),用標(biāo)記選擇對發(fā)掘遺傳潛力較為有效;然而當(dāng)目標(biāo)性狀由多個基因控制時(shí),由于需要選擇世代較多,加劇了標(biāo)記與QTL位點(diǎn)間的重組,降低了標(biāo)記選擇效果;在少數(shù)QTL可解釋大部分變異的情況下,MAS效率較高。二、應(yīng)用實(shí)例：《利用SNP和EST-SSR分子標(biāo)記鑒定荔枝新種質(zhì)御金球》，孫清明，李永忠，向旭，等，2013年11卷第3期，第403-414頁，分子植物育種（MolecularPlantBreeding）分子標(biāo)記輔助育種MAS

此項(xiàng)研究利用自主開發(fā)的荔枝SNP和EST-SSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)，對近年發(fā)掘的荔枝優(yōu)稀種質(zhì)御金球進(jìn)行分子鑒定，明確其與現(xiàn)有的363份荔枝種質(zhì)的親緣關(guān)系，以探索其是否為新種質(zhì)，并揭示親本來源，為進(jìn)行新品種保護(hù)提供分子證據(jù)。SNP分型技術(shù)首次成功地用于荔枝新種質(zhì)御金球的親本來源鑒定，為今后荔枝種質(zhì)的鑒別提供了可借鑒手段1、實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料。此研究共用364份。1.2EST-SSR檢測。引物來源：引物序列來自孫清明等(2011)，從中挑選13對多態(tài)性高，擴(kuò)增穩(wěn)定的EST-SSR引物用于種質(zhì)分析。PCR反應(yīng)：使用BiometraPCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增；94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，28個循環(huán)；72℃5min。采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓150V,時(shí)間2h)進(jìn)行PCR產(chǎn)物分離，電泳緩沖液(1TBE)，參照McCouch等(1997)的方法進(jìn)行銀染顯色。數(shù)據(jù)分析：利用NTSYS2.10e軟件進(jìn)行相似性數(shù)據(jù)分析，采用SM系數(shù)計(jì)算種質(zhì)之間的相似性系數(shù)，進(jìn)行UPGMA聚類。分子標(biāo)記輔助育種MAS1.3SNP檢測。引物設(shè)計(jì)：將前期獲得的兩個荔枝品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，從中發(fā)掘SNP位點(diǎn)，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。PCR反應(yīng)：利用BiometraPCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：變性(95℃

3min)；50個擴(kuò)增循環(huán)(95℃

15s,(55±1℃)10s,72℃8s)；變性、復(fù)性(94℃30s,28℃30s）。HRM（高分辨率熔解曲線技術(shù)(highresolutionmelting,HRM)由于具有高通量快速準(zhǔn)確分析簡單等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于人類致病基因突變的SNP分型診斷中）檢測及數(shù)據(jù)分析：利用LightCycler(Spectron)進(jìn)行HRM檢測；利用MEGA5中的Align進(jìn)行序列比對，UPGMA進(jìn)行種質(zhì)間系統(tǒng)演化分析,并計(jì)算演化分化系數(shù)。2、結(jié)果與分析2.1御金球與現(xiàn)有363份荔枝種質(zhì)的親緣關(guān)系。

13對EST-SSR引物在供試的364份種質(zhì)中共產(chǎn)生122條譜帶，其中多態(tài)性條帶112條，多態(tài)性比例為91.8%。御金球與其他種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)介于0.1230~0.8770之間，可見，御金球不同于其他363份荔枝種質(zhì)。分子標(biāo)記輔助育種MAS

從50對SNP引物中篩選出17對（見表）擴(kuò)增效率高分型效果明顯的SNP引物。利用這些引物對御金球與現(xiàn)有363份荔枝種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系分析結(jié)果表明，17對SNP引物均表現(xiàn)為二等位性，御金球與其它363份荔枝種質(zhì)的演化分化系數(shù)介于0.043~1.924之間，可見SNP分型同樣證明御金球是一份新種質(zhì)。分子標(biāo)記輔助育種MAS2.2御金球22份疑似親本種質(zhì)的親緣關(guān)系分析。選擇22份御金球的疑似親本種質(zhì)，對其進(jìn)行EST-SSR和SNP分子標(biāo)記鑒定分析。

EST-SSR分析表明，御金球與22疑似親本的相似系數(shù)為0.4590~0.8443。從圖3可以看出，御金球與糯米糍的親緣關(guān)系最近(相似系數(shù)為0.8443)，隨后與紅燈籠聚到一起，并最終與懷枝類(同沙遲懷枝,焦核懷枝和懷枝)聚到一起；而與廣東廣西和云南來源的胭脂紅并未首先聚到一起可見，御金球不同于胭脂紅，而是與糯米糍及懷枝類型的種質(zhì)更相似一些。分子標(biāo)記輔助育種MASSNP分析與EST-SSR的鑒定結(jié)果相似御金球與22份疑似親本種質(zhì)的演化分化系數(shù)介于0.088~1.804之間。其中，與糯米糍的分化系數(shù)最小(0.088)，與三月紅的分化系數(shù)最大。圖4的聚類分析同樣表明，御金球與糯米糍的親緣關(guān)系最近，來自廣西和廣東的胭脂紅與紅燈籠和焦核懷枝首先聚在一起后，才與糯米糍和御金球這一分支聚到一起。分子標(biāo)記輔助育種MAS2.3御金球的親本來源鑒別。

利用17個SNP位點(diǎn)對御金球及其22份疑似親本進(jìn)行等位基因型檢測。判定親本的標(biāo)準(zhǔn)為一個位點(diǎn)的二等位基因中，只要有一個等位基因與御金球的相同，該材料即為御金球的推測親本。從表4（部分）中可以看出，在22份疑似親本種質(zhì)中，只有焦核懷枝和紅燈籠的17個SNP位點(diǎn)表現(xiàn)為二等位基因或其中一個等位基因與御金球完全相同，因此這兩個品種為御金球的推測親本；其余種質(zhì)與御金球存在1~12個SNP位點(diǎn)的差異。例如：分子標(biāo)記輔助育種MAS此外，在SNP35這個位點(diǎn)上，御金球?yàn)殡s合型AG，焦核懷枝為AA

從表4可以看出，糯米糍(GG)和紅燈籠(AG)在該位點(diǎn)可能成為其另一個親本的來源，但從起源時(shí)間上判斷，紅燈籠母樹樹齡遠(yuǎn)小于御金球母樹樹齡，因此可排除紅燈籠是御金球親本來源的可能，結(jié)合親緣關(guān)系分析，本研究推測御金球是來源于以糯米糍為母本焦核懷枝為父本的有性雜種后代。3、討論

EST-SSR、SNP等分子標(biāo)記是近年開發(fā)的兩類特異性強(qiáng)的遺傳標(biāo)記EST-SSR是基于EST文庫開發(fā)的新型SSR標(biāo)記，不同于傳統(tǒng)的基因組SSR(gSSR)標(biāo)記，除具有遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高、檢測迅速和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)外，還反映了基因的外顯子區(qū)段，可以直接獲得基因表達(dá)的信息，這就有可能對決定重要表型性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定。SNP即為單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(singlenucleotidepolymorphism)，是指由同一位點(diǎn)的不同等位基因之間個別核苷酸的差異或者小的插入缺失等變異所造成的一種DNA序列的多態(tài)性。分子標(biāo)記輔助育種MASSNP的共顯性及二等位的特點(diǎn)使得SNP成為一種較為有效的鑒定品種親本來源的分子標(biāo)記技術(shù)。

分析結(jié)果表明，SNP分型技術(shù)還需要與品種的起源信息相結(jié)合，比如僅從17個SNP位點(diǎn)(表4)看，焦核懷枝和紅燈籠均可能為御金球的親本之一，但卻無法判定；從農(nóng)藝性狀如葉片形狀上看，二者與御金球都很相似，但從品種的起源信息看，焦核懷枝是一個起源較早的品種，但紅燈籠母樹樹齡尚不足30年屬于實(shí)生變異，可能為懷枝的自交后代。御金球來自于廣東省珠海市斗門鎮(zhèn)斗門村，其母樹應(yīng)有80年生以上。御金球的起源早于紅燈籠，紅燈籠即不可能為御金球的親本；由此可以判定，焦核懷枝是御金球的親本之一。盡管紅燈籠不是御金球的親本，本研究依據(jù)EST-SSR和SNP的結(jié)果可以推測，御金球與紅燈籠可能是姊妹系。那么，御金球到底是由焦核懷枝自交產(chǎn)生，還是其與其它品種雜交產(chǎn)生的后代呢，將二者的SNP位點(diǎn)進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)：在SNP35這個位點(diǎn)上，焦核懷枝為AA，而御金球?yàn)锳G；；御金球在該位點(diǎn)的雜合型表明其