艾滋病病毒(HIV)初篩實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制標準操作程序

艾滋病病毒(HIV)初篩實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制標準操作程序【目的】：科主任、專業(yè)主管。【方法】【分析前質(zhì)控】一、人員培訓實驗是人操作的，因此檢驗人員需經(jīng)過培訓，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識：1、檢驗項目的基本原理(ELISA原理)。3、熟悉檢測技巧，了解易出差錯的環(huán)節(jié)及難點。4、熟悉檢測試劑性能(包括試劑盒組成，包被片段及其組成)。5、熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識。6、需參加有關(guān)部門組織的專門培訓班，測試合格后持證上崗。二、室內(nèi)質(zhì)控血清的制備：1、收集陽性血清(無明顯溶血、黃膽、脂肪血和污染血清,到一定量(夠本室使用3-6個月的量)。3、過濾，除纖維沉淀物。4、稀釋，用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀釋。5、測定值，和定值參考品進行對比、求值，一般定在CutOff值附近的陽性值。【試劑盒選擇】必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標簽的產(chǎn)品?！驹噭┖性u價】試劑評價需要有權(quán)威的血清考核盤(Panel)進行檢測，價格昂貴，操作繁瑣，一般實驗室不易開展，可以通過以下信息，了解試劑質(zhì)量。1、根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量計劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑。比例混合或化學合成)，片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣。3、參考室間質(zhì)評報告中對試劑的評價結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控成績。4、根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的試劑評價結(jié)果，了解市場上試劑的質(zhì)量優(yōu)劣?！緝x器質(zhì)控】為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應建立維護和校正儀器的標準操作程序(SOP)，所要控制的儀器包括移液器(加樣槍)，水浴箱(溫箱)，洗板機和酶標儀。1.移液器：ELISA加樣量小(5-100ul)，其準確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±10%以內(nèi)。2.水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中(或溫箱內(nèi))實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差。墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞。線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.000~2.000，新型號的可測范圍為0.000~2.900，而其線性范圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制作標準【酶標儀校正程序】可見分光光度計(波長精度±0.3nm)于可見光區(qū)對每個濾光片進行掃描，其檢測值和標定50nm濾光片的檢定選用普魯蘭溶液(校正波長為630nm)。2、通道差和孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標板小孔杯(杯底須光滑，透明，無污染)以酶標板架作載體，將其(內(nèi)含200ul甲基橙溶液吸光度調(diào)至0.500A左右)置于8個通道的相應位置，蒸餾水調(diào)零，于490nm處連續(xù)測三次,觀察其不同通道的檢測器測量結(jié)ulA蒸3、零點飄移(穩(wěn)定性觀察)：取8只小孔杯分別置于8個通道的相應位置，均加入20mV取其均值。計算其回歸方程，相關(guān)系數(shù)及標準估計誤差S，并用±1.96S表示樣品測量的誤差范圍。雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液，分別加入3種不同濃度的溶血液(測定波長否具有統(tǒng)計學差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果。【標本的采集和保存】1、標本采集時應盡量避免溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀2、細菌污染的標本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽性，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會產(chǎn)反應。3、抗凝不完全的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。4、標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般【分析中質(zhì)控】數(shù)均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點。因此，應建立實驗項目的標準操作程序(SOP)。一、加樣1、加樣使用微量移液器(加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。2、每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。4、如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。二、溫育3、反應板不宜疊放，注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定控制，一個人操作時，一次不宜三、洗滌1、手工洗滌一般采用浸泡方法：1)甩去孔內(nèi)反應液；2)用洗滌液過洗一遍(即注滿2、洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地HRP同樣需要一定的時間和溫度。2、一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度(一般為37°C，10-15分鐘)恒定反應后終止。五、酶標儀判讀結(jié)果1、顯色反應終止后應立刻比色(30分鐘內(nèi))。MB盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定3、使用雙波長的優(yōu)點可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應板使用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片?！痉治龊筚|(zhì)控】【報告方式】2)、COV=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于競爭，中和法。3)、COV=N+C(C為常數(shù))，用于間接法。4)、COV=C×P+N(C為常數(shù))，用于間接法。此公式最客觀，但對廠家要求很高，陰陽性對照測定值要基本恒定。二、定量分析：嚴禁用定性試劑盒做定量分析。1、用已知量的系列標準品，繪制標準曲線，結(jié)果以絕對量或單位表示。ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上。2、現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的【記錄】1、所有實驗的原始資料均應存檔；所有的記錄均應規(guī)范登記在冊；原始登記表應記錄試劑來源、