染色體涂染技術(shù)課件

染色體涂染技術(shù)

Chromosomepaintingtechniques

染色體涂染技術(shù)

染色體涂染技術(shù)即將整條染色體、某條染色體臂（長臂或短臂）或者染色體某個片斷的DNA制備成探針，然后用熒光原位雜交的方法，將探針雜交到中期分裂相染色體上，在熒光顯微鏡下觀察熒光素在染色體上標記的顏色，從而分析和研究染色體的重組、畸變以及同源基因等的一種新技術(shù)。

染色體涂染技術(shù)1.染色體DNA探針的制備；2.熒光原位雜交。1.染色體DNA探針的制備①流式細胞分類法（flowcytometry）

該法是用一種或多種熒光染料將懸浮液中的中期分裂相染色體染色。由于染色體大小、形態(tài)、組成和結(jié)構(gòu)的不同，所染色的特征有其特異性，從而可以通過流式細胞術(shù)將特定的染色體收集起來。1.染色體DNA探針的制備

①流式細胞分類法（flowcytometry）局限性：如果受試物的染色體形態(tài)單一、數(shù)目較多，如牛(2n=60)和狗(2n=78)的所有常染色體及綿羊(2n=54)和馬(2n=64)的大部分常染色體都是端位著絲點，因此，僅根據(jù)染色體的形態(tài)和大小很難將所有的染色體準確地區(qū)分開來。1.染色體DNA探針的制備

②克隆基因庫或體細胞雜交株通過特定的克隆基因文庫或者特異性的體細胞雜交細胞系制備某條染色體整個或部分DNA探針。該法特異性強，準確性高，并且可以與功能遺傳學的研究結(jié)合起來，但對實驗室要求較高，取材來源和研究范圍有所限制。

1.染色體DNA探針的制備③染色體顯微切割和PCR擴增

顯微切割(microdissection)技術(shù)是在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下直接或通過顯微操作系統(tǒng)對欲選取的材料進行切割分離并收集用于后續(xù)研究的技術(shù)。

染色體顯微切割分手工切割和激光切割法，倒置顯微鏡上裝配切割臂，安上硅化玻璃針，找到分散良好的分裂相來切割所需染色體片段。1.染色體DNA探針的制備

③通過染色體顯微切割和PCR擴增制備特異性的染色體DNA探針。相對而言，該方法具有直接、準確、簡便和應用范圍廣等優(yōu)點。

2.熒光原位雜交

fluorescentinsituhybridazation,FISH

什么是原位雜交？原位雜交是基于DNA分子復制原理而發(fā)展起來的一種技術(shù)。用帶有標記（放射性同位素、熒光染料等）的DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA）片段進行雜交，然后用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在及定位。2.熒光原位雜交

基本原理：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。2.熒光原位雜交實驗流程：

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。

2.熒光原位雜交

優(yōu)點:

熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；

探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用；實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確；可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針當；

多色FISH在同一個核中顯示不同顏色可同時檢測多種序列；

既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以