新生SD大鼠神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及分化研究,神經(jīng)生物學論文

新生SD大鼠神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及分化研究,神經(jīng)生物學論文神經(jīng)干細胞是存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一群具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞，能夠分化構(gòu)成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞[1,2].近年來，神經(jīng)干細胞的研究成為神經(jīng)科學領(lǐng)域的熱門之一。神經(jīng)干細胞移植被以為是治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病最具前景的方案之一[3].本研究采用新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠作為供體，分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，通過觀察、檢測神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞分化的生物學特性，為神經(jīng)干細胞的分化研究提供更多實驗根據(jù)。1材料與方式方法1.1實驗動物新生24小時內(nèi)清潔2級SD大鼠，購于南方醫(yī)科大學動物實驗中心。1.2主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基，D-Hanks液〔Hyclone〕，B27神經(jīng)細胞生長添加劑〔Gibco〕,bFGF、EGF〔Peproteeh〕，多聚賴氨酸〔Sigma〕，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。nestin抗體購自Chemi-con公司，NF200和GFAP抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。臺盼藍、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供。1.3實驗方式方法1.3.1NSCs的原代分離培養(yǎng)NSCs的分離：取新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠4只，用75%乙醇消毒頭部后，斷頭處死，在超凈臺內(nèi)以眼科剪逐層剪開始皮及顱骨后，無菌條件下迅速取出端腦及中腦放入預冷的D-Hanks液中，去除腦膜及血管后剪碎，加入0.125%胰酶、0.02%EDTA液4ml,37℃消化20~30min后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基4ml終止消化，輕柔吹打至混懸液后，用400目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1000rpm離心5min,棄去上清，用D-Hanks重復清洗3遍后，參加完全培養(yǎng)基〔含2%B27,20g/LbFGF,20g/LEGF的DMEM/F12培養(yǎng)基〕重懸細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù)后，調(diào)整細胞密度為1106/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后的細胞每2~3d半量換液，培養(yǎng)6~7d傳代1次。逐步去除碎片及其他細胞，分離出NSCs.1.3.2NSCs的傳代培養(yǎng)在原代培養(yǎng)第7天，無菌條件下進行傳代培養(yǎng)。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，用吸管將沉在瓶底而沒有貼壁的神經(jīng)球收集入離心管，棄去貼壁的細胞，1500rpm離心5min,吸去上清液后，加入NSCs完全培養(yǎng)基，輕柔吹打使神經(jīng)球盡可能分離為單細胞懸液，計數(shù)后仍以1106/ml接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。此后每2~3d半量換液，培養(yǎng)6~7d傳代1次。1.3.3NSCs的免疫化學鑒定取生長良好的第3代NSCs克隆球，1105/ml接種至預先放置多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)8小時，使大部分克隆球貼壁，將蓋玻片取出自然晾干。PBS清洗2次，每次5min,用4%多聚甲醛固定30min后，PBS清洗干凈后以3%H2O2去離子水孵育10min,清洗3次，再以山羊血清封閉液37℃封閉10min.滴加一抗nestin〔1∶100〕,37℃孵育2小時，PBS清洗3次，每次5min,滴加二抗B液37℃孵育20min,PBS清洗3次，再滴加C液37℃孵育15min,詳細步驟參照SP試劑盒講明書。PBS清洗3次后DAB顯色，蘇木素復染，封片。對照染色以PBS代替一抗，余一樣。1.3.4NSCs的誘導多向分化取含生長良好的第3代NSCs克隆球的細胞懸液，1500rpm離心5min,棄去上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12〔1∶1〕培養(yǎng)液輕柔吹打為單細胞懸液后，接種于多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片的24孔板內(nèi)，隨時觀察NSCs分化狀態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)7天后，進行GFAP和NF200的免疫細胞化學染色，方式方法步驟同nestin.2結(jié)果2.1NSCs形態(tài)學觀察及免疫細胞化學鑒定倒置顯微鏡下動態(tài)觀察原代培養(yǎng)NSCs,細胞懸液接種24小時后可見大量單個大小相近的圓形細胞，細胞核大，胞質(zhì)較少，折光性較高；2~3d半定量換液后可見較多懸浮生長的形態(tài)不一的細胞球，呈桑椹狀，每個細胞球由數(shù)個到數(shù)十個細胞組成，折光性強，無突起生長；6~7d后，生長成由上百個細胞組成的大克隆球〔圖1a〕。神經(jīng)細胞克隆球經(jīng)免疫細胞化學染色后，神經(jīng)干細胞特異性表示出的巢蛋白nestin呈強陽性表示出，胞漿呈棕黃色〔圖1b〕.2.2NSCs的誘導分化將培養(yǎng)第3代的NSCs克隆球用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進行誘導分化，12小時后可見到部分NSCs克隆球緊貼細胞培養(yǎng)瓶，很多偽足樣突起從克隆球中伸出；分化至第3天時，可見很多單個細胞逐步從克隆球中遷出，細胞由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)橛型黄鸬募毎矆D2〕。培養(yǎng)至第7天時，細胞突起明顯增加，細胞之間構(gòu)成廣泛的網(wǎng)絡(luò)狀構(gòu)造。2.3NSCs誘導多向分化細胞的免疫細胞化學鑒定將NSCs培養(yǎng)至第7天時，細胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，采用不同神經(jīng)細胞特異性抗體進行免疫細胞化學鑒定。結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細胞標記抗體GFAP在多角形胞體分化細胞的胞漿中呈陽性表示出〔圖3a〕。此類細胞從胞體伸出很多長的突起，連成網(wǎng)狀。神經(jīng)元標記抗體NF200在卵圓形胞體分化細胞的胞漿中呈陽性表示出〔圖3b〕。該類細胞發(fā)出突起相對較少，大部分細胞發(fā)出2個細胞突起。3討論近年來，NSCs已被研究證實廣泛分布于胚胎和成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的若干區(qū)域。胚胎腦的端腦、海馬、紋狀體、中腦、室管膜/室管膜下區(qū)、脊髓和成年腦的腦室下區(qū)、紋狀體、海馬顆粒下區(qū)等已成功分離培養(yǎng)出NSCs[2].NSCs因其具有自我維持、自我更新、可遷徙性、轉(zhuǎn)分化性、低免疫原性、多向分化潛能等生理特性，使其成為基因治療的載體或供體細胞，且可在Ⅳ型膠原的誘導下分化為平滑肌細胞介入神經(jīng)組織血管再生，為臨床上脊髓損傷、帕金森病、周圍神經(jīng)損傷后肌肉萎縮的治療等提供了新的思路和方式方法[4~7].本研究從新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠的端腦及中腦成功地分離培養(yǎng)了NSCs,NSCs在含有能刺激神經(jīng)干細胞增殖的生長因子B27、bFGF和EGF無血清培養(yǎng)液中大量增殖，呈懸浮球形生長，并連續(xù)傳代生長，具體表現(xiàn)出NSCs自我維持和自我更新的特性。巢蛋白〔nestin〕是中間絲蛋白家族的成員，被列為第Ⅵ類中間絲蛋白，該蛋白主要在神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細胞及神經(jīng)前體細胞中表示出，能夠作為神經(jīng)干細胞和神經(jīng)前體細胞以及胰島前體細胞的特異性標志物[8].巢蛋白的表示出是暫時性的，一旦前體細胞分化成終末分化細胞如神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞，巢蛋白的表示出便終止[9,10].我們的實驗結(jié)果可見，經(jīng)過傳代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞克隆球nestin呈強陽性表示出，表示清楚了經(jīng)傳代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞克隆球保持了神經(jīng)干細胞特性。當去除神經(jīng)干細胞增殖的生長因子的作用，NSCs置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，NSCs發(fā)生分化，不僅表現(xiàn)為細胞生長方式發(fā)生改變，由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，而且細胞形態(tài)也發(fā)生了改變，由圓形分化為卵圓形、多角形等多種形態(tài)的有突起細胞。隨著細胞的繼續(xù)分化，細胞突起明顯增加，分化細胞之間構(gòu)成廣泛的網(wǎng)絡(luò)狀構(gòu)造。成熟星形膠1酸性蛋白〔GFAP〕和神經(jīng)元標記抗體NF200.我們采用免疫細胞化學顯示，GFAP和NF200在分化細胞中呈陽性表示出，表示清楚神經(jīng)干細胞經(jīng)過誘導分化后，部分細胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞和