流式細胞術(shù)在科研中的應(yīng)用描述

流式細胞術(shù)在科研中的應(yīng)用描述第1頁/共55頁

流式細胞術(shù)在科研中的應(yīng)用

第2頁/共55頁什么是流式細胞儀●流式細胞儀實物BDFACSVantageBD-Calibur第3頁/共55頁流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細胞大小前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復(fù)雜性第4頁/共55頁外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖第5頁/共55頁熒光信號熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標記的細胞與無熒光標記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細胞與低FL細胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。第6頁/共55頁熒光信號雙色直接染色第7頁/共55頁流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點圖和直方圖。幾個概念：%Gated：陽性細胞百分比。反映細胞群體中陽性細胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達量有關(guān)，在正態(tài)分布時一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強度，在陽性細胞為偏態(tài)分布時一般用該值。第8頁/共55頁散點圖

密度圖二維等高圖直方圖圖報告中常見的幾種流式細胞圖第9頁/共55頁圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死第10頁/共55頁流式細胞儀數(shù)據(jù)分析點圖分析第11頁/共55頁流式細胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析第12頁/共55頁圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞第13頁/共55頁當前流式細胞分析發(fā)展趨勢從相對細胞計數(shù)到絕對細胞計數(shù)從相對定量到絕對定量分析從單色到多色熒光分析從細胞膜成分到細胞內(nèi)成分分析從細胞分析到可溶性成分的流式細胞分析第14頁/共55頁今天主要內(nèi)容：流式細胞術(shù)在細胞凋亡檢測中的應(yīng)用流式細胞術(shù)在腫瘤細胞DNA倍體中的應(yīng)用流式細胞儀的分選功能流式細胞術(shù)在蛋白檢測中的應(yīng)用第15頁/共55頁細胞凋亡檢測第16頁/共55頁1、半胱氨酸蛋白酶3檢測法（早早期）2、AnnexinV-FITC/PI法（早期）3、Apo2.7檢測法（早期）4、TUNEL法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細胞凋亡相關(guān)蛋白的流式細胞術(shù)檢測流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡第17頁/共55頁細胞凋亡的分析細胞凋亡的主要表現(xiàn)細胞內(nèi)水解酶改變：如Caspase-3活化細胞膜不對稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI細胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實驗（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相關(guān)蛋白：FasBcl-2第18頁/共55頁細胞凋亡——ActiveCaspases-3第19頁/共55頁細胞凋亡——Caspases-3第20頁/共55頁細胞凋亡——AnnexinⅤ第21頁/共55頁凋亡檢測（AnnexinV/PI法）

PIAnnexinV-FITC第22頁/共55頁DNA倍體的流式分析第23頁/共55頁細胞DNA含量檢測細胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結(jié)合于細胞DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。

第24頁/共55頁第25頁/共55頁單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期細胞，兩者中間代表S期細胞。這是以2倍體和4倍體細胞為主的流式DNA圖第26頁/共55頁DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

第27頁/共55頁第28頁/共55頁2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體第29頁/共55頁含量與凋亡關(guān)系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。凋亡過程中，細胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標本制備中的固定處理時，細胞膜的完整性被破壞，使細胞內(nèi)降解的DNA片段從細胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。第30頁/共55頁第31頁/共55頁第32頁/共55頁Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

圖FCM測試細胞周期分布和凋亡第33頁/共55頁流式細胞儀的細胞分選功能第34頁/共55頁分選：用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，大型機分選速度可達到每秒上萬個細胞第35頁/共55頁488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第36頁/共55頁流式分選與分子生物學(xué)研究除了將分選得到的細胞進行后續(xù)培養(yǎng)研究外，F(xiàn)CM分選系統(tǒng)可為PCR、FISH等分子技術(shù)提供純度較高的特異性細胞群，減少研究中的干擾因素，獲得更準確的實驗結(jié)果。第37頁/共55頁CytometricBeadsArray(CBA)

流式液相多重蛋白

定量技術(shù)第38頁/共55頁導(dǎo)言常規(guī)的蛋白分析方法：ELISA：一次反應(yīng)只能檢測一個指標Westernblot：不能對蛋白精確定量不足之處：檢測多個指標需耗費大量樣本分批操作導(dǎo)致組間差異大操作繁瑣，耗時耗力如何能夠從單個微量樣本中一次檢測多個目標蛋白，并加以定量，獲得高精確度的數(shù)據(jù)呢？針對于此，BD-Pharmingen成功研發(fā)了基于流式細胞儀檢測平臺的液相多重蛋白定量技術(shù)——BDCytometricBeadArray，簡稱CBA

第39頁/共55頁CBA技術(shù)簡介CBA是一系列帶有不同強度紅色熒光、包被有捕獲抗體的微球，類似ELISA的捕獲孔板，可以捕獲液相樣本（血清、血漿或者細胞培養(yǎng)上清液等）中相應(yīng)的抗原，再結(jié)合PE標記檢測抗體，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，通過流式細胞儀進行熒光檢測，便可同時對樣本中的多種可溶性蛋白成分進行定量++AnalyteofinterestFluorescentdetectionAb

captureBead

captureAbBead第40頁/共55頁BDCytometricBeadArray123不同強度紅色熒光的捕獲微球，在FCMFL3檢測不同的目標蛋白PE標記的檢測抗體，在FCMFL2檢測。PE的熒光強度即反映靶蛋白的含量456第41頁/共55頁HumanTh1/Th2LymphokineCBATh1/Th2panel:IL2,IL4,IL5,IL10,TNF,IFN用

FL3熒光的強度不同區(qū)別種不同的微球（beads）DirectsandwichimmunoassayFL2(PE)detectorreagent樣本處理6cytokinesfroma50Lsample

Threepipettingsteps 3hourtotalincubation QuantitativeresultsandcompletereportgenerationSoftwareassistedquantitativeanalysis,withcurvefittingalgorithmResultreportingincludedinsoftware第42頁/共55頁HumanTh1/Th2LymphokineCBA第43頁/共55頁

Chemokine-ICBAAssayStandard0pg/mlCBAAssayStandard第44頁/共55頁10pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第45頁/共55頁20pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第46頁/共55頁40pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第47頁/共55頁80pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第48頁/共55頁156pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第49頁/共55頁312pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第50頁/共55頁625pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第51頁/共55頁1250pg/mlCBAAssayStandardcont.Chemokine-ICBAAssayStandard第52頁/共55頁2500pg/mlCBAAssayStandardcont.Che