蛋白質(zhì)的分離純化和表征

蛋白質(zhì)的分離純化和表征第1頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)

1.蛋白質(zhì)的酸堿性蛋白質(zhì)也是兩性電解質(zhì)，溶液的pH可以改變蛋白質(zhì)的帶電情況。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（等離子點(diǎn)）受組成蛋白質(zhì)的酸性氨基酸和堿性氨基酸數(shù)目的影響。第2頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二

2.蛋白質(zhì)的大分子特性

a滲透與滲透壓

溶劑分子由稀溶液向濃溶液?jiǎn)畏矫娴膬粢苿?dòng)稱為稱為滲透。滲透壓是溶液分子在平衡濃度時(shí)的凈水壓，是蛋白質(zhì)的依數(shù)性之一。

第3頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二第4頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二

b蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散現(xiàn)象由于濃度差導(dǎo)致的溶質(zhì)分子的凈遷移，稱為擴(kuò)散。擴(kuò)散系數(shù)的大小與蛋白質(zhì)形狀、大小及溶劑的粘度有關(guān)。

c蛋白質(zhì)分子的沉降特性蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí)發(fā)生移動(dòng)的現(xiàn)象稱為沉降。沉降的速度與蛋白質(zhì)分子的大小、形狀、密度及溶劑的密度和粘度、溫度等有關(guān)。沉降系數(shù)用S做單位。第5頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二

d蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)及沉淀分散相質(zhì)點(diǎn)的半徑介于1-100nm時(shí)形成的均勻分散的溶液，稱為膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液作為膠體溶液，穩(wěn)定的原因是蛋白質(zhì)分子表面的水化層和雙電層。沉淀蛋白質(zhì)的方法：大量的中性鹽、極性有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑、加熱第6頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二二、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1.透析和超濾

2.密度梯度離心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度

3.凝膠過濾層析(分子排阻層析)

分離蛋白質(zhì)常用的凝膠的商品名：Sephadex

某一蛋白質(zhì)樣品在凝膠柱上的分配系數(shù)

Kav=Ve:該蛋白質(zhì)的洗脫體積

Vo:凝膠柱的空隙體積(外水體積)Vt:凝膠柱的總體積Ve－VoVt－Vo第7頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二凝膠過濾層析原理示意圖第8頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二（二）利用溶解度差別純化蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的溶解度受到溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等因素的影響，所以改變以上條件，可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。

1.通過改變?nèi)芤簆H值的等電點(diǎn)沉淀法

2.通過改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度的鹽析、鹽溶

3.有機(jī)溶劑的分級(jí)沉淀

4.通過改變溫度的沉淀法第9頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二（三）根據(jù)電荷不同純化蛋白質(zhì)

1.電泳紙電泳或薄膜電泳粉末電泳細(xì)絲電泳

凝膠電泳平板電泳柱狀電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳第10頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二

（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)第11頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二濃縮膠樣品分離膠在PAGE中，除了一般的電荷效應(yīng)外，還有凝膠對(duì)樣品的分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)，三種效應(yīng)共同起作用，使樣品的分離效果大大提高。第12頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二

（2）等電聚焦電泳(IEF)Ph=3pH=10連續(xù)pH梯度的凝膠和樣品電泳第13頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二兩性電解質(zhì)載體

ampholite第14頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二（3）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)在SDS和少量的巰基乙醇存在時(shí)，蛋白質(zhì)分子解聚并處于完全展開的狀態(tài)，SDS以其烴基鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合物，每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基相當(dāng)于結(jié)合一個(gè)SDS分子，使得蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中的遷移率完全取決于相對(duì)分子量而同本身所帶的電荷及形狀無關(guān)。第15頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二第16頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二

2.離子交換層析纖維素離子交換層析交鏈葡聚糖離子交換層析第17頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二

（三）根據(jù)對(duì)配基的生物學(xué)特性的分離：

親和層析親和層析是利用生物親和力，即蛋白質(zhì)分子和其配基之間特有的識(shí)別能力而建立的一種純化方法。第18頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法

1.根據(jù)化學(xué)組成測(cè)最低相對(duì)分子量

2.由滲透壓測(cè)相對(duì)分子量

3.沉降分析法測(cè)相對(duì)分子量

沉降速度法：蛋白質(zhì)分子在離心力作用下沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng)，產(chǎn)生沉降界面，通過測(cè)定界面的移動(dòng)速度求出蛋白質(zhì)的分子量。

沉降平衡法：蛋白質(zhì)在高速離心力作用下逐漸沉降，直至其浮力與離心力相等時(shí)為止。第19頁，共21頁，2023年，2月20日，星期二

4.凝膠過濾法測(cè)相對(duì)分子量在一定的分子量