實時熒光定量PCR技術(shù)實驗操作流程

———實時熒光定量PCR技術(shù)實驗操作流程

實時熒光定量PCR，簡稱RT-QPCR,屬于Q-PCR的一種，目前該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，如：擴(kuò)增特異性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等。熒光定量PCR最常用的方法是DNA結(jié)合染料SYBRGreenⅠ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法。

SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的熒光染料，可與所有的各種序列的雙鏈DNA分子結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，嵌入至dsDNA，熒光大大增強(qiáng)。

因此，SYBRGreenI的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，PCR擴(kuò)增不同時期中，dsDNA含量不同，SYBRGreenI熒光信號強(qiáng)度不同?？梢愿鶕?jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量，并可根據(jù)對照進(jìn)行相關(guān)的計算和分析。

實驗前準(zhǔn)備

實驗開始前，需準(zhǔn)備好實驗所需的各種試劑和耗材。

試劑包括：特異性PCR引物，新鮮提取備用的總RNA。

使用的試劑盒有：用于合成cDNA第一鏈的羅氏試劑盒TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit，包含了cDNA反應(yīng)所需要的所有實驗組分以及相關(guān)的正對照反應(yīng)組分。配套LightCycler480使用的試劑盒LightCycler480SYBRGreenIMaster，包含了PCR所需的各種實驗組分，如1號管中包含熱啟動TaqDNAPolymerase及反應(yīng)緩沖液，dNTPmix，SYBRGreenI染料和MgCl2

正式試驗開始前，冰上解凍各個試劑及試劑盒組分，置于冰上待用。注意：SYBRGreenIMaster需避光放置。

所需儀器與耗材有：LightCycler480全自動實時定量PCR儀以及配套使用的96或384多孔板，透明封板膜等一次性耗材。朗基T30PCR儀、rainin單道移液器、Nunc冰盒及NEST盒裝吸頭等。

實驗操作流程：

1.用新鮮提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行實時熒光定量PCR，其中包括：SYBRGreen反應(yīng)體系的配置；PCR程序設(shè)置；運(yùn)行PCR實驗，樣品編輯和結(jié)果分析。

2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈實驗操作時注意：所有RNA相關(guān)的操作均要佩戴手套，防止RNase污染。

相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行相關(guān)操作。

按照體系配方在冰上的Rnasefree的滅菌PCR管中配置Templateprimermix，總體系13l，本實驗是聯(lián)合使用anchoredoligodT引物和隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄。先配置NTC對照，加入9號管水10l、6號管的50mMoligodT引物1l、5號管的0.6mM隨機(jī)六聚體引物2l，混勻。然后進(jìn)行樣品一號管的體系配置，依次加入1l已調(diào)整濃度的總RNA、1loligodT引物、2l隨機(jī)六聚體

引物、最后加9l水補(bǔ)充至總體積13l，混勻。其他樣品管，參照1號管的配置方法，依次加好反應(yīng)體系。

注意：可將總RNA的模板量適當(dāng)調(diào)整至10ng-5g，mRNA調(diào)整至1-100ng。若RNA樣品濃度較低，則可加入10g/ml的MS2RNA來穩(wěn)定模板RNA。將配好的反應(yīng)mix在PCR儀中65℃變10min，可有效減少RNA的二級結(jié)構(gòu)。加熱后迅速置于冰上驟冷，放置5min。在反應(yīng)Templateprimermix中按體系配方順序，依次加入以下試劑：2號管的5反轉(zhuǎn)錄酶buffer，4號管dNTPmix，3號管40U/l的RNase抑制劑，1號管20U/l的反轉(zhuǎn)錄酶，最終體積為20l。若樣品數(shù)較多，先配置反應(yīng)mix再分裝，小心吸打混合，切勿渦旋振蕩。混勻后于瞬時離心機(jī)上短暫離心，使樣品和反應(yīng)液落至離心管底部。

將離心管放置PCR中，根據(jù)使用的引物以及目標(biāo)mRNA的片段長度進(jìn)行程序設(shè)置。本實驗反應(yīng)溫度和時間設(shè)置為：25℃，10min，55℃反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢后，于85℃下加熱5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，再置于冰上停止反應(yīng)。

此反應(yīng)產(chǎn)物可于2-8℃存放1-2h，或在-15至-25℃下存放更長時間。

3.Q-PCR擴(kuò)增

cDNA產(chǎn)物無需進(jìn)行純化即可用于后續(xù)的PCR反應(yīng)。20l的PCR反應(yīng)體系可取2-5lcDNA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。此試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄酶具有RNaseH活性，可以在cDNA合成之后去除RNA模版，減少其對后續(xù)PCR的影響。

本部分實驗，我們選用SYBRGreenIMaster試劑盒進(jìn)行定量分析。本實驗共設(shè)置5個標(biāo)準(zhǔn)樣品，包含1個標(biāo)記為0的空白對照，5個反轉(zhuǎn)錄樣品，包含NTC對照，由于樣品數(shù)較多，先配制不含模版的總體系，再分裝為10管，加入各個樣品的模板后，再將每個樣品分裝為3個復(fù)孔。

按照體系配方分別加入綠色蓋子的2MasterMix，10xPrimer上下游引物，PCR級別水?？傮w系配好后，在用移液槍輕柔吸打均勻，然后分裝為10管，每管55l。往10管中分別加入各個樣品對應(yīng)的調(diào)整好濃度的cDNA。

STD零加入6l水代替模板，其余STD分別加入6l已經(jīng)逐級稀釋好的標(biāo)樣模板。反轉(zhuǎn)錄樣品分別加入6l濃度調(diào)整好的模板DNA，包含NTC。混勻，然后將每個樣按20l每孔分裝至96孔板中。用封孔膜蓋好96孔板，將多孔板置于合適的離心機(jī)中1500g配平離心2min將準(zhǔn)備好的96孔板放置在LightCycler480設(shè)備中。

4.程序設(shè)定

雙擊打開LightCycler480的1.5軟件并登陸，自動進(jìn)入軟件界面，點(diǎn)擊newexperiment,在DetectionFormat選項中選擇SYBRGreenI模式,點(diǎn)擊OK完成檢測通道的設(shè)定,接下來設(shè)置反應(yīng)體積，對于96模塊，反應(yīng)體系為10l-100l之間，本實驗是設(shè)定20l的反應(yīng)體系。

在ProgramName中輸入反應(yīng)名稱preincubation，預(yù)變性設(shè)定1個循環(huán)，無需進(jìn)行熒光的收集，執(zhí)行的溫度和時間設(shè)定為95℃10min，視圖會根據(jù)設(shè)定進(jìn)行實時的調(diào)整。點(diǎn)擊增加按鈕，輸入Amplification，定義擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)為45次，并選擇熒光的收集功能Quantification，然后設(shè)定PCR擴(kuò)增循環(huán)的溫度與時間為95℃10s，點(diǎn)擊增加按鈕，設(shè)定退火溫度和時間為60℃10s，以上兩步AcquisitionMode都默認(rèn)選擇None，繼續(xù)點(diǎn)擊增加按鈕，設(shè)置延伸溫度和時間為72℃20s，AcquisitionMode選擇Single，RampRate均按自動調(diào)整值，無需再設(shè)置。

設(shè)置溶解曲線，在Program中的新的一行中輸入MeltingCurves，1個循環(huán)數(shù)，AnalysisMode選擇MeltingCurves，時間和溫度設(shè)置為95℃5s，點(diǎn)擊增加按鈕，新增設(shè)置溫度和時間為65℃1min，以上兩步AcquisitionMode都默認(rèn)選擇None。點(diǎn)擊增加按鈕，新增設(shè)置溫度為95℃，AcquisitionMode選擇Continuous,其他設(shè)置無需改動。設(shè)置保溫的過程Cooling，只需1個循環(huán)，無需收集熒光，設(shè)定溫度和時間為40℃、1min。設(shè)置完成后點(diǎn)擊右邊的保存按鈕保存設(shè)置的程序。此時整個PCR

的循環(huán)體系、溫度的設(shè)置已經(jīng)設(shè)定完畢。

點(diǎn)擊Startrun開始運(yùn)行PCR反應(yīng)，此時可在軟件上實時監(jiān)測樣品擴(kuò)增情況。

5.樣品編輯

實驗結(jié)束，點(diǎn)擊SampleEditor，進(jìn)入樣本編輯區(qū)。SelectWorkflow中選擇AbsQuant。根據(jù)樣本在板中排布的方式進(jìn)行樣本編輯。設(shè)置陰性對照、空白對照、標(biāo)準(zhǔn)品以及未知樣品等。

在SelectSample中，選中需要設(shè)置的樣品孔。在下一欄中的SampleName輸入被選擇樣品組的名稱，并在SampleType中選擇樣品組的類型，最后點(diǎn)擊MakeReplicates設(shè)置復(fù)孔。標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置時，需填寫拷貝數(shù)，只需填寫好稀釋倍數(shù)，初始濃度即可。編輯好樣品后，即可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如有需要，也可進(jìn)行子集編輯。

6.結(jié)果分析

樣品編輯好后，可進(jìn)行實驗結(jié)果分析。點(diǎn)擊左邊欄下方的sum按鈕，相應(yīng)出現(xiàn)實驗的所有信息，包括：設(shè)計的反應(yīng)程序，實驗結(jié)果分析等。點(diǎn)擊analysis，可以根據(jù)樣品已有的數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)致準(zhǔn)確地分析。點(diǎn)擊AbsQuantsecondderivativemax，彈出createnewanalysis窗口，在Subset選項中選擇分析樣品的分布區(qū)域，點(diǎn)擊確定，即可出現(xiàn)分析圖：相應(yīng)樣品的擴(kuò)增曲線。

StandardCurve是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線左側(cè)標(biāo)有擴(kuò)增效率、斜率、截距、線性關(guān)系、以及