應(yīng)用文章 使用脂質(zhì)納米顆粒對(duì)人類原代 T 細(xì)胞進(jìn)行基因編輯

———應(yīng)用文章使用脂質(zhì)納米顆粒對(duì)人類原代T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯

嵌合抗原受體(CAR)在T細(xì)胞上的表達(dá)將患者的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為基于細(xì)胞的癌癥療法，并徹底改變了當(dāng)今的癌癥治療格局。盡管這項(xiàng)技術(shù)取得了成功，并獲得了業(yè)界的積極響應(yīng)，但市場(chǎng)對(duì)于借助CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜基因工程的需求日益高漲。復(fù)雜基因工程的應(yīng)用包括：破壞腫瘤微環(huán)境所利用的抑制途徑、提高CART細(xì)胞的效率4,5和使用同種異體供體生產(chǎn)通用CART細(xì)胞。業(yè)界迫切希望在下一代T細(xì)胞療法中同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因編輯和轉(zhuǎn)基因表達(dá)，這凸顯了在細(xì)胞功能、細(xì)胞產(chǎn)量、生產(chǎn)簡(jiǎn)化和放大工藝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的遺傳物質(zhì)遞送方法的重要性。一種有前景的新型T細(xì)胞工程方法是，使用RNA來(lái)表達(dá)治療性蛋白質(zhì)和基因編輯核酸酶。RNA通常通過(guò)電穿孔遞送至細(xì)胞，但在多步基因工程中使用連續(xù)電脈沖時(shí)，需要在效率和細(xì)胞活力之間進(jìn)行仔細(xì)權(quán)衡。而脂質(zhì)納米顆粒(LNP)則無(wú)需進(jìn)行這種權(quán)衡，使其成為一種具有吸引力的RNA遞送替代方法。LNP是完全合成的脂質(zhì)配方，用于在將RNA遞送到細(xì)胞之前對(duì)其進(jìn)行包封和保護(hù)。目前，LNP的生產(chǎn)已經(jīng)成熟，并且可放大用于大規(guī)?；蜻f送和基因編輯，而這是滿足當(dāng)下和未來(lái)臨床需求的關(guān)鍵。RNA-LNP復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上與低密度脂蛋白(LDL)類似，并可以利用LDL的內(nèi)源性攝取途徑，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。這種溫和的攝取機(jī)制能夠成功地進(jìn)行T細(xì)胞基因工程，同時(shí)保持高細(xì)胞活力。

在本文中，我們報(bào)告了一種使用GenVoy-ILMTCellKitformRNA對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)基因工程的新型方法。我們利用優(yōu)化的生產(chǎn)工作流程來(lái)遞送各種RNA（圖1）。在本案例研究中，我們介紹了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的T細(xì)胞受體(TCRɑ)敲除(KO)技術(shù)，并探討了使用多步LNP工程（一種有前景的同種異體CART細(xì)胞療法）來(lái)產(chǎn)生TCRɑKOCART細(xì)胞。我們還詳細(xì)描述了LNP生產(chǎn)和細(xì)胞培養(yǎng)處理方案，以及T細(xì)胞基因編輯的優(yōu)化策略，以確保使用GenVoy-ILMTCellKitformRNA成功進(jìn)行基因工程。圖1.使用脂質(zhì)納米顆粒對(duì)人類

原代T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯。

基因敲除是通過(guò)遞送Cas9mRNA和合成向?qū)NA(sgRNA)實(shí)現(xiàn)的。在遞送和翻譯后，Cas9蛋白和sgRNA在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合，并穿梭到細(xì)胞核中進(jìn)行靶基因的雙鏈斷裂。如果沒有DNA供體模板，絕大多數(shù)斷裂會(huì)通過(guò)易突變的非同源末端連接(NHEJ)進(jìn)行結(jié)合，從而永久性敲除靶蛋白。

原代T細(xì)胞的基因編輯可以通過(guò)許多酶來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)和成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)Cas9。其中，CRISPR/Cas9因易于進(jìn)行靶標(biāo)選擇和優(yōu)化而越來(lái)越受歡迎。在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯中，Cas9蛋白通過(guò)向?qū)NA被導(dǎo)向靶DNA，并誘導(dǎo)雙鏈斷裂，這些斷裂大多通過(guò)非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)。RNA導(dǎo)向的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠靈活地進(jìn)行靶標(biāo)選擇和多重基因編輯，為CART細(xì)胞治療創(chuàng)造了巨大的潛力

傳統(tǒng)上，病毒載體用于T細(xì)胞工程，但存在幾個(gè)限制，包括有限的包載量、不良免疫反應(yīng)和高生產(chǎn)成本。為了避免病毒載體的這些缺點(diǎn)，電穿孔的使用日益普及；然而，如上所述，同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因編輯和蛋白質(zhì)表達(dá)所需的連續(xù)電脈沖可能對(duì)細(xì)胞有害。這會(huì)降低細(xì)胞活力和產(chǎn)量，造成基因失調(diào)，并增加細(xì)胞衰竭標(biāo)記基因的表達(dá)。

盡管LNP相關(guān)研究的數(shù)量有限，但Billingsley等人的兩項(xiàng)近期研究表明，與電穿孔和/或慢病毒轉(zhuǎn)染相比，原代T細(xì)胞中LNP介導(dǎo)的CD19CARmRNA表達(dá)具有同等的腫瘤殺傷效力。

GenVoy-ILMTCellKitformRNA提供了一種臨床相關(guān)、可放大的LNP基因編輯方法，以推進(jìn)細(xì)胞治療領(lǐng)域的發(fā)展，其利用的LNP技術(shù)也是變革新冠肺炎mRNA疫苗開發(fā)工作的強(qiáng)大技術(shù)。這項(xiàng)工作旨在展示LNP在治療性蛋白表達(dá)和先進(jìn)T細(xì)胞工程中的強(qiáng)大作用。我們對(duì)用于包封商用Cas9mRNA和向?qū)NA(sgRNA)的LNP的封裝、包載比率和多導(dǎo)向組合進(jìn)行了優(yōu)化。此外，我們展示了LNP可以無(wú)縫整合到標(biāo)準(zhǔn)原代T細(xì)胞培養(yǎng)工作流程中，以及多次LNP添加如何產(chǎn)生基因編輯的CART細(xì)胞。借助NanoAssmblrSpark微流控平臺(tái)，這些研發(fā)規(guī)模的RNA-LNP在不到5分鐘的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生，并直接添加到細(xì)胞中。

這項(xiàng)工作表明，使用GenVoy-ILMTCellKitformRNA生產(chǎn)的LNP能夠高效地進(jìn)行靶標(biāo)敲除（兩個(gè)sgRNA為808%）和CAR蛋白表達(dá)(915%)，同時(shí)保持高細(xì)胞活力(90%)。所得的基因編輯CART細(xì)胞與白血病細(xì)胞共培養(yǎng)，并顯示出高效的靶標(biāo)特異性殺傷作用，而基因編輯本身對(duì)治療潛力沒有負(fù)面影響。圖2.原代T細(xì)胞基因編輯和多步工程工作流程。第1天-解凍并活化凍存的人類原代PanT細(xì)胞。第1-4天生產(chǎn)LNP，評(píng)估RNA包封效率以確定劑量。第4天-活化的T細(xì)胞與基因編輯RNA-LNP一起孵育。第4-11天-細(xì)胞擴(kuò)增以增加細(xì)胞數(shù)量用于隨后的實(shí)驗(yàn)。第13天-用CARmRNA-LNP處理基因編輯細(xì)胞，表達(dá)治療性抗CD