轉(zhuǎn)基因動植物制藥

轉(zhuǎn)基因動植物制藥第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二S1轉(zhuǎn)基因動物制藥乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點其他動物生物反應(yīng)器第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷了三個不同的歷史階段：天然藥物化學(xué)合成藥物基因工程藥物基因工程制藥也經(jīng)歷了三個階段：發(fā)酵工程細(xì)胞工程轉(zhuǎn)基因動物大腸桿菌酵母等微生物把人或哺乳動物的基因直接導(dǎo)入哺乳動物的細(xì)胞利用轉(zhuǎn)基因動物制藥第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1980年，Gordon用DNA顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠1982年，Palmiter獲得“超級”小鼠1985年，轉(zhuǎn)基因兔、綿羊、豬1986年，轉(zhuǎn)基因牛第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1987年，第一個動物乳腺生物反應(yīng)器模型：Gorden等利用組織纖溶酶原激活劑（tPA）與小鼠乳清酸蛋白（WAP）啟動子重組基因，在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中表達(dá)了tPA。第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二動物乳腺生物反應(yīng)器（mammaryglandbioreactor）是指利用動物乳腺特異性啟動子調(diào)控元件指導(dǎo)外源基因在乳腺中特異性表達(dá)，并能從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應(yīng)器。第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1991年，英國愛丁堡制藥公司，轉(zhuǎn)基因綿羊：羊乳中含有1-抗胰蛋白酶（1-AT），含量高達(dá)16g/L，估計泌乳期的每只羊可產(chǎn)70g，價值達(dá)70萬美元FDA已批準(zhǔn)應(yīng)用基因技術(shù)公司（AGTC）α1－AT進(jìn)入II期臨床實驗第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1-AT缺乏癥：新生兒肝炎、肝硬化、肝癌、肺氣腫彈性蛋白酶破壞肝細(xì)胞細(xì)菌蛋白酶破壞肺組織α1-AT基因位于第14號染色體。α1-AT是肝臟產(chǎn)生的一種糖蛋白，廣泛分布于唾液、十二指腸液、呼吸道分泌物、淚液、鼻腔分泌物和腦脊液，是人體內(nèi)血清蛋白酶的主要抑制物。第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用目前，國際上已有30多家公司正在開發(fā)乳腺生物反應(yīng)器。第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用2006年：世界上第一個利用轉(zhuǎn)基因動物（山羊）乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程藥物重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn

）上市

〔美國Genzyme公司旗下的GTCBiotherapeutics公司〕重組人抗凝血酶Ⅲ：可抑制血液中凝血酶活性，用于預(yù)防和治療血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥具有顯著效果。全球每年的潛在市場約為1.5億美元。第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用其他應(yīng)用：利用轉(zhuǎn)基因綿羊、牛和兔乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人α-抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺氣腫）人組織纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA,抗栓藥）人C1抑制劑（治療血管神經(jīng)性水腫）等這些重組蛋白藥物也已經(jīng)完成或進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗。另外還有10多種重組蛋白藥物處于臨床研究，上百種重組蛋白處于研發(fā)階段。

第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用據(jù)美國權(quán)威機(jī)構(gòu)預(yù)測，到2010年，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額將達(dá)到350億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個基因工程藥物種類的90%以上。第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點1、產(chǎn)量高，成本低蛋白血漿內(nèi)水平（g/L）重組蛋白水平（g/L）動物種屬1-抗胰蛋白酶1.4~3.2小鼠10.0山羊7.0血紅蛋白——豬32.0長效t-PA——山羊3.0抗凝血酶III0.17~0.39綿羊16.0小鼠10.0哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)：重組蛋白表達(dá)量為0.1～1g/L第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二乳腺組織是一種高效的產(chǎn)奶器官：奶牛：8000～10000L/頭·年，綿羊和山羊：800～1000L/頭·年1、產(chǎn)量高，成本低以最低表達(dá)量1g/L的重組蛋白計算：奶牛：8～10kg/頭·年綿羊和山羊：0.8～1kg/頭·年一頭奶牛重組蛋白年產(chǎn)量相當(dāng)于1000L發(fā)酵罐乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二以防治A型血友病的凝血因子Ⅷ為例：美國目前的需求總量是120g血漿提?。盒?20萬升血漿，1200萬人次捐血轉(zhuǎn)基因動物：只需1.2頭轉(zhuǎn)基因牛

1、產(chǎn)量高，成本低乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點生產(chǎn)1g重組蛋白的成本：乳腺生物反應(yīng)器：0.02-0.50美元哺乳動物細(xì)胞：

800-5000美元第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二2、周期短一種新藥從研制開發(fā)、通過藥審直到上市，約需10-15年的周期，用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物，周期可縮短5年。3、產(chǎn)品的質(zhì)量好，高活性生產(chǎn)的重組蛋白藥物生理活性好，與人同源性高，非常接近天然產(chǎn)品。乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二3、設(shè)備簡單，不耗能，無污染該技術(shù)基本上為一畜牧業(yè)過程，雖飼養(yǎng)環(huán)境要求特別潔凈，但仍是給牛羊草料，由牛羊奶中提取藥品，因此蛋白生產(chǎn)過程不需昂貴設(shè)備，不消耗能源，不會產(chǎn)生工業(yè)廢料，也不會對環(huán)境產(chǎn)生污染，因此動物乳腺生物反應(yīng)器制藥技術(shù)是一種可持續(xù)發(fā)展的新型生物制藥技術(shù)。

乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點PharmingFarming第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二其他動物生物反應(yīng)器動物乳腺生物反應(yīng)器動物血液生物反應(yīng)器動物膀胱生物反應(yīng)器

精液、蛋清、蠶繭動物生物反應(yīng)器的主要類型第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二動物血液生物反應(yīng)器血液中表達(dá)，大型家畜血液豐富，屠宰即可收獲產(chǎn)物產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)：有些物質(zhì)會影響動物健康（如激素、細(xì)胞分裂素、血纖維溶酶因子等）外源蛋白與內(nèi)源蛋白難分離可生產(chǎn)人血紅蛋白、抗體、生長激素及非活性狀態(tài)的融合蛋白第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二動物膀胱生物反應(yīng)器報道較少，生產(chǎn)人生長激素取得初步成果優(yōu)點：1、從尿液中收集產(chǎn)物對動物無傷害2、分離純化經(jīng)濟(jì)有效，不需除脂肪等3、生產(chǎn)周期短，不管是雌、雄動物從出生開始就可獲得表達(dá)產(chǎn)物第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二精液系統(tǒng)有些動物精液很豐富并易于收集，如豬第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二精液系統(tǒng)研究例子：小鼠的P12基因啟動區(qū)可特異地驅(qū)動在雄性小鼠的附性腺表達(dá)，已用來表達(dá)人生長激素。該激素在轉(zhuǎn)基因小鼠精液中高達(dá)0.5mg/ml精液系統(tǒng)與尿液一樣，具有特異性的優(yōu)點，但復(fù)雜的蛋白質(zhì)在此兩種系統(tǒng)中成熟與分泌的情況如何，目前尚不太清楚第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二蛋清系統(tǒng)蛋清含量豐富，所含蛋白質(zhì)的量高，且分泌到體外，有望成為重組蛋白質(zhì)的優(yōu)良生產(chǎn)系統(tǒng)最近已得到在蛋清中生成外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因雞，但在總體上，禽類的轉(zhuǎn)基因技術(shù)還不成熟第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二蠶繭系統(tǒng)蠶繭含有大量的蠶絲蛋白質(zhì)，也具有乳汁和蛋清所具有的某些性質(zhì)往卵中注射線性質(zhì)粒，或利用多角體病毒載體都可以成功地實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因蠶易于大量繁殖，也有望開發(fā)成生物反應(yīng)器外源蛋白的成熟有待評估第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二S2轉(zhuǎn)基因植物制藥植物細(xì)胞工程是指定向改造植物細(xì)胞遺傳性，利用植物細(xì)胞生產(chǎn)有用物質(zhì)的技術(shù)。目前應(yīng)用最廣的有三方面內(nèi)容：1、植物的無性快速繁殖及育種2、細(xì)胞大量培養(yǎng)及生產(chǎn)藥用成分（次生代謝物生產(chǎn)）3、轉(zhuǎn)基因植物：疫苗、抗體等第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程疫苗第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程疫苗第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程抗體第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程抗體第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程抗體第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二其他重組蛋白藥物第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二其他重組蛋白藥物第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二S2轉(zhuǎn)基因植物制藥植物基因工程疫苗的可行性研究植物基因工程疫苗的基本原理植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇植物表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)方式植物基因工程疫苗的優(yōu)勢存在問題及今后研究重點第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二可行性研究1、Curtiss&Cardineau（1990）發(fā)表了第一篇關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物疫苗的文獻(xiàn)2、Mason（1992）等報道了乙肝表面抗原在植物中的表達(dá)，提出了利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗的概念3、Arntzen（1992）：在植物中表達(dá)的乙肝抗原能保持蛋白質(zhì)折疊的特性，保留了激發(fā)Ｂ細(xì)胞和Ｔ細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原決定簇4、Modelska（1998）&Brennan（1999）：植物基因工程疫苗以粘膜組織給藥的方式可引起粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二基本原理1、將病毒或病原體的抗原基因在植物中進(jìn)行高效表達(dá)2、抗原蛋白仍保留自然狀態(tài)的免疫原性，當(dāng)將它產(chǎn)生的抗原作為食物時，可刺激體液和粘膜免疫應(yīng)答，可安全通過動物消化道而不會被蛋白酶降解，成為粘膜性抗原只需口服少量表面抗原蛋白就可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇要根據(jù)不同的需要和轉(zhuǎn)化的難易程度，選擇不同的表達(dá)系統(tǒng)1、煙草：作為模式植物易操作，易種植并大量供應(yīng)，葉組織在5-6ｗ內(nèi)即可用于分析；但是葉組織中含有有毒物質(zhì)，不能用于飼喂研究2、馬鈴薯：容易轉(zhuǎn)化，有些塊莖特異性表達(dá)啟動子，8-10ｗ內(nèi)即可用于分析；但它蛋白含量低第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇3、豆類或谷類作物：種植廣泛、產(chǎn)量高、種子中重組蛋白表達(dá)含量較高，種子易于儲存，適合于飼喂動物用于免疫，用于動物疫苗較為理想4、番茄、黃瓜等蔬菜類：可生食，生產(chǎn)人類疫苗5、香蕉：老少皆宜，用于人類疫苗理想的植物，但轉(zhuǎn)化效率不高，需大量口服才能達(dá)到較好免疫效果6、玉米：主要的飼料原料，不需經(jīng)提取，使用方便，在飼喂動物的同時就可預(yù)防疾病的發(fā)生，成本低于其他疫苗第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)方式穩(wěn)定表達(dá)

——外源抗原基因直接轉(zhuǎn)染植物基因組瞬時表達(dá)

——植物病毒載體瞬時表達(dá)外源抗原基因第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二穩(wěn)定表達(dá)啟動子：主要采用CaMV35S組成型表達(dá)啟動子，但其表達(dá)水平較低應(yīng)用：乙肝表面抗原（HBsAg）、鏈球菌變異株spaＡ蛋白、大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素Ｂ亞單位和霍亂毒素Ｂ亞單位等優(yōu)點：可通過雜交生產(chǎn)多價疫苗第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二瞬時表達(dá)利用植物病毒作為載體，將目的基因插入到病毒基因組中，然后將重組病毒接種到植物葉片上，這樣，隨著病毒的復(fù)制，外源基因被高效的表達(dá)出來。1、將抗原基因置于病毒基因組啟動子控制之下2、將抗原基因與病毒外殼蛋白融合在一起第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二瞬時表達(dá)載體：椰菜花葉病毒（CaMV）、煙草花葉病毒（TMV）和豇豆花葉病毒（CMPV）馬鈴薯X病毒（PVX）特點：表達(dá)產(chǎn)量比較高，在接種后1-2ｗ內(nèi)外源基因就可達(dá)到最大量的積累。第41頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二瞬時表達(dá)植物病毒作為瞬時表達(dá)的載體的優(yōu)點：1、病毒增殖速度快，外源基因在較短的時間內(nèi)，通常在接種后1-2周以內(nèi)就可達(dá)到最大量的積累2、病毒增殖水平較高，可使伴隨的外源基因有高水平表達(dá)第42頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二瞬時表達(dá)植物病毒作為瞬時表達(dá)的載體的優(yōu)點：3、植物病毒的基因組很小，易于進(jìn)行遺傳操作，而大多數(shù)植物病毒可以通過機(jī)械接種感染植物，這樣適于大規(guī)模的商業(yè)操作4、植物病毒可以侵染單子葉等非農(nóng)桿菌的寄主植物，擴(kuò)大了轉(zhuǎn)基因的適用范圍

第43頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二植物基因工程疫苗