生物技術(shù)制藥第7章

生物技術(shù)制藥第7章第1頁(yè)/共52頁(yè)本章主要內(nèi)容第一節(jié)概述第二節(jié)酶的來(lái)源和生產(chǎn)第三節(jié)酶和細(xì)胞的固定化第四節(jié)酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用第五節(jié)酶工程研究進(jìn)展第2頁(yè)/共52頁(yè)第一節(jié)概述一、酶的特性酶(enzyme)是由生物體活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化功能的一類蛋白質(zhì)，也被稱為生物催化劑。多數(shù)酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，有些酶是核酸。酶作為生物催化劑的，除具有一般催化劑的特性：加快反應(yīng)速度、降低反應(yīng)活化能、不改變反應(yīng)平衡點(diǎn)、反應(yīng)前后無(wú)數(shù)量和性質(zhì)變化等。第3頁(yè)/共52頁(yè)還具有獨(dú)有的特點(diǎn)：催化效率高專一性強(qiáng)反應(yīng)條件溫和催化活性易受調(diào)節(jié)和控制第4頁(yè)/共52頁(yè)二、酶工程簡(jiǎn)介是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透、發(fā)展而形成的一門新的技術(shù)科學(xué)。從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異催化功能，并通過(guò)工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。第5頁(yè)/共52頁(yè)第二節(jié)酶的來(lái)源和生產(chǎn)一、酶的來(lái)源普遍存在于生物體中，可直接從生物體中分離。化學(xué)合成方法目前還不成熟。早期是以動(dòng)植物為原料進(jìn)行提取，由于動(dòng)植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、來(lái)源有限、受地理、氣候和季節(jié)等因素的影響，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，利用微生物來(lái)生產(chǎn)酶制品是一個(gè)更好的選擇。

第6頁(yè)/共52頁(yè)利用微生物來(lái)生產(chǎn)酶制品優(yōu)點(diǎn)

1、微生物種類繁多，動(dòng)植物體內(nèi)的酶在微生物中幾乎都可以找到；2、繁殖快、生產(chǎn)周期短3、培養(yǎng)簡(jiǎn)便、并可以通過(guò)控制培養(yǎng)條件來(lái)提高產(chǎn)量；4、微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，通過(guò)各種遺傳變異手段能培育出新的高產(chǎn)菌株。

第7頁(yè)/共52頁(yè)二、酶的生產(chǎn)菌1、對(duì)菌種的要求產(chǎn)酶量高，酶的性能符合使用要求，最好是胞外酶；不是致病菌、在系統(tǒng)發(fā)育上與病源體無(wú)關(guān)，不產(chǎn)生毒素；穩(wěn)定，不易變異退化，不易感染噬菌體；生產(chǎn)成本低,能利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。第8頁(yè)/共52頁(yè)2、生產(chǎn)菌來(lái)源菌種保藏機(jī)構(gòu)、有關(guān)研究部門；從自然界中分離篩選，土壤、深海、溫泉、火山、森林都是菌種采集地，篩選包括菌樣采集、菌種分離、初篩、純化、復(fù)篩、生產(chǎn)性能鑒定。第9頁(yè)/共52頁(yè)3、常用產(chǎn)酶微生物大腸桿菌（最常用的產(chǎn)酶微生物）：一般屬于胞內(nèi)酶，需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎才能得到。谷氨酸脫羧酶，用于測(cè)定谷氨酸含量或γ-氨基丁酸；天冬氨酸酶，催化延胡索酸加氨生成L-天冬氨酸；芐青霉素?；?，生成新的半合成青霉素或頭孢霉素；β-半乳糖苷酶，用于分解乳糖。第10頁(yè)/共52頁(yè)枯草桿菌：α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸脂酶。青霉菌：產(chǎn)黃青霉用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶；橘青霉用于生產(chǎn)脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶。第11頁(yè)/共52頁(yè)黑曲霉：有胞外酶和胞內(nèi)酶，糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纖維素酶。米曲霉：糖化酶和蛋白酶，在傳統(tǒng)的酒曲和醬油曲中得到廣泛應(yīng)用。木霉：纖維素酶，含有較強(qiáng)的17α-羥化酶，常用于甾體轉(zhuǎn)化。第12頁(yè)/共52頁(yè)根霉：糖化酶、α-淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶，含有較強(qiáng)的11α-羥化酶，常用于甾體轉(zhuǎn)化。鏈霉菌：葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素?；?、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，含有豐富的11α-羥化酶，可用于甾體轉(zhuǎn)化。第13頁(yè)/共52頁(yè)啤酒酵母：釀造啤酒、酒精、飲料酒和面包制造。可生產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶等的生產(chǎn)。第14頁(yè)/共52頁(yè)三、提高藥用酶產(chǎn)量的措施1、添加誘導(dǎo)物2、控制阻遏物濃度3、添加表面活性劑4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑第15頁(yè)/共52頁(yè)1、添加誘導(dǎo)物對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物，可使產(chǎn)酶量顯著提高。乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶。誘導(dǎo)物可分為三種：酶的作用底物、酶的反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類似物。第16頁(yè)/共52頁(yè)有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用，應(yīng)設(shè)法解除阻遏作用來(lái)提高酶的產(chǎn)量。2、控制阻遏物濃度第17頁(yè)/共52頁(yè)3、添加表面活性劑可分為離子型和非離子型，離子型對(duì)細(xì)胞有毒害作用，只能使用非離子型，可聚集在細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞通透性，有利于酶的分泌，可增加酶的產(chǎn)量。第18頁(yè)/共52頁(yè)4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑植酸鈣鎂可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1-20倍。第19頁(yè)/共52頁(yè)第三節(jié)酶和細(xì)胞的固定化使用純酶的缺點(diǎn)：只能使用一次，成本高，產(chǎn)品分離困難；酶溶液很不穩(wěn)定，容易變性和失活。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：性能穩(wěn)定；可反復(fù)使用，降低了成本，易與產(chǎn)品分離，簡(jiǎn)化下游操作。第20頁(yè)/共52頁(yè)一、固定化酶的制備1、定義限制或固定于特定空間位置的酶，即經(jīng)物理化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失、運(yùn)動(dòng)受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。第21頁(yè)/共52頁(yè)2、固定化酶的特點(diǎn)（1）、可以多次使用，而且在多數(shù)情況下，酶的穩(wěn)定性提高；（2）、反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開(kāi)，產(chǎn)物中無(wú)殘留酶，易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高；（3）、反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制；（4）、酶的利用效率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量減少；（5）、比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。第22頁(yè)/共52頁(yè)第四節(jié)酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用酶工程的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單、效率高、生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小、產(chǎn)品收率高、純度好、還可制造出化學(xué)方法無(wú)法生產(chǎn)的產(chǎn)品。第23頁(yè)/共52頁(yè)一、酶在疾病預(yù)防和治療方面的應(yīng)用1、蛋白酶臨床上使用最早、用途最廣的藥用酶之一。消化劑，用于治療消化不良和食欲不振，使用時(shí)常常與淀粉酶、脂肪酶等一起制成復(fù)合酶制劑，以增加療效，片劑，可口服。第24頁(yè)/共52頁(yè)消炎劑，對(duì)各種炎癥有很好的療效，它能分解一些蛋白質(zhì)和多肽，使炎癥部位的壞死組織溶解，增加組織的通透性，抑制浮腫，促進(jìn)病灶附近組織積液的排出并抑制肉芽的形成，可口服、外敷和肌肉注射。第25頁(yè)/共52頁(yè)蛋白酶經(jīng)組織注射可治療高血壓，由于蛋白酶催化運(yùn)動(dòng)遲緩素原及胰血管舒張素原的部分肽段水解生成運(yùn)動(dòng)遲緩素和胰血管舒張素，從而使血壓下降。第26頁(yè)/共52頁(yè)2、α-淀粉酶消化藥。3、脂肪酶消化劑。假單胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂蛋白和乳糜微粒，可用于預(yù)防和治療高血脂病。第27頁(yè)/共52頁(yè)4、右旋糖苷酶水解右旋糖苷生產(chǎn)小分子產(chǎn)物，對(duì)齲齒有顯著的預(yù)防作用，可加到牙膏和淑口水中。第28頁(yè)/共52頁(yè)抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛作用，作用于細(xì)胞壁，使其受到破壞，而使病原菌、腐敗性細(xì)菌等溶解死亡。5、溶菌酶第29頁(yè)/共52頁(yè)6、超氧化物歧化酶抗氧化、抗輻射、抗衰老、保護(hù)機(jī)體的DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜免受超氧負(fù)離子的破壞。對(duì)紅斑狼瘡、皮膚炎、結(jié)腸炎、白內(nèi)障、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氧中毒等疾病有顯著療效，對(duì)輻射有防護(hù)作用。第30頁(yè)/共52頁(yè)治療乳糖缺乏癥，有些人或嬰兒腸道中缺乏乳糖酶，飲用含有乳糖的牛奶等食品時(shí)，由于不能分解乳糖，在腸道中，乳糖會(huì)因?yàn)榧?xì)菌分解而產(chǎn)生有機(jī)酸，刺激腸道引起嘔吐。7、乳糖酶第31頁(yè)/共52頁(yè)8、鏈激酶可催化纖維蛋白酶原，激活成纖維蛋白酶，將纖維蛋白水解，使血栓溶解。9、尿激酶溶解血栓。第32頁(yè)/共52頁(yè)二、固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素G經(jīng)青霉素?；缸饔?，水解除去側(cè)鏈后的產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸（6-APA），也稱無(wú)側(cè)鏈青霉素。它是生產(chǎn)半合成青霉素的最基本原料。第33頁(yè)/共52頁(yè)6-氨基青霉烷酸（6-APA）第34頁(yè)/共52頁(yè)技術(shù)路線產(chǎn)青霉素?；傅?5頁(yè)/共52頁(yè)第五節(jié)酶工程研究進(jìn)展包括酶的修飾、酶的人工模擬、有機(jī)相的酶反應(yīng)和基因工程酶的構(gòu)建。第36頁(yè)/共52頁(yè)一、酶的化學(xué)修飾1、目的和意義天然酶的缺陷：易于變性失活（酸、堿、有機(jī)溶劑、熱）；容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制；工業(yè)反應(yīng)要求的酸度和溫度并不總是在酶反應(yīng)的最適酸度和溫度范圍內(nèi)；底物不溶于水，或酶的米式常數(shù)過(guò)高；酶做為藥物在體內(nèi)的半衰期較短等因素限制了酶制劑的應(yīng)用。第37頁(yè)/共52頁(yè)酶的化學(xué)修飾：對(duì)酶在分子水平上用化學(xué)方法進(jìn)行改造，即在體外將酶分子通過(guò)人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶分子的酶學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。第38頁(yè)/共52頁(yè)目的：提高酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶分子的免疫原性（醫(yī)藥）。意義:擴(kuò)大了酶制劑的應(yīng)用范圍，同時(shí)化學(xué)修飾法也是研究酶的活性中心性質(zhì)的重要手段。第39頁(yè)/共52頁(yè)2、常用化學(xué)修飾劑要求：較大相對(duì)分子量；良好的生物相容性和水溶性；分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)；修飾后酶的半衰期較長(zhǎng)。第40頁(yè)/共52頁(yè)常用修飾劑

糖及糖的衍生物：右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝膠，聚乳；高分子多聚物：聚乙二醇，聚乙烯醇；生物大分子：肝素，血漿蛋白質(zhì)，聚氨基酸；雙功能試劑：戊二醛，二胺；其他：固定化酶載體，糖基化試劑，甲基化試劑，乙基化試劑和小分子有機(jī)化合物。第41頁(yè)/共52頁(yè)3、修飾方法（1）、修飾酶的功能基團(tuán)酶分子中可解離的基團(tuán)如氨基、羥基、羧基、巰基等都可以修飾。如脫氨基可消除酶分子表面氨基酸的電荷；通過(guò)碳二亞胺反應(yīng)，可以改變側(cè)鏈羧基的性質(zhì)；通過(guò)?；磻?yīng)可改變側(cè)鏈羥基的性質(zhì)。第42頁(yè)/共52頁(yè)（2）、酶分子內(nèi)或分子間進(jìn)行交聯(lián)，應(yīng)用某些雙功能試劑可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)部不同肽鏈部分進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。第43頁(yè)/共52頁(yè)（3）修飾酶的輔因子，可將輔因子共價(jià)結(jié)合在酶分子上，或引入新的或修飾過(guò)的具有強(qiáng)反應(yīng)性的輔因子。（4）、酶與高分子化合物結(jié)合，蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合后可提高穩(wěn)定性。第44頁(yè)/共52頁(yè)4、修飾酶的特性穩(wěn)定性提高、抗各類失活因子的能力提高、抗原性消除、體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)、最適酸度改變、酶化學(xué)性質(zhì)改變，對(duì)組織分布能力改變。第45頁(yè)/共52頁(yè)5、前景酶分子經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后，并不是所有的缺點(diǎn)都可以克服了，并且修飾的結(jié)果難以預(yù)測(cè)，今后，應(yīng)選用更多的、合適的修飾方法，如使用基因工程法、蛋白質(zhì)工程法、人工模擬法和某些物理修飾法等，使酶的性質(zhì)進(jìn)一步改善。第46頁(yè)/共52頁(yè)二、有機(jī)相的酶反應(yīng)有機(jī)相酶反應(yīng)指酶在具有有機(jī)溶劑存在的介質(zhì)中所進(jìn)行的催化反應(yīng)。這是一種在極端條件（逆性環(huán)境）下進(jìn)行的酶反應(yīng)，它可以改變某些酶的性質(zhì)。第47頁(yè)/共52頁(yè)有機(jī)相酶反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)：增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度；熱力學(xué)平衡向合成方向移動(dòng)；可抑制有水參與的副反應(yīng)；酶不溶于有機(jī)溶劑，易于回收再利用；容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物；酶的熱穩(wěn)定性提高，酸度適用范圍擴(kuò)大；無(wú)微生物污染；能測(cè)定某些在水介質(zhì)中不能測(cè)定的常數(shù)；固定化酶方法簡(jiǎn)單，可以只沉淀在載體表面。第48頁(yè)/共52頁(yè)有機(jī)相酶反應(yīng)的溶劑體系水-水溶性溶劑均相體系；水-水不溶性溶劑兩相體系；單相有機(jī)溶劑體系。有機(jī)相的酶工程但在有機(jī)相中，天然酶容易變性而失活、分散性差、容