高通量測序服務(wù)簡介2課件

高通量測序服務(wù)與數(shù)據(jù)分析服務(wù)簡介高通量測序簡介高通量測序技術(shù)（第二代或下一代測序技術(shù)，nextgenerationsequencing)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，因此在研究中又被稱為深度測序(deepsequencing)。基于illumina的solexa與羅氏454的高通量測序平臺，欣景生物可提供不同物種樣本的各種類型的二代測序服務(wù)。根據(jù)樣本RNA或者DNA的不同應(yīng)用可分為表達(dá)組測序、microRNA測序、基因組測序等。高通量測序數(shù)據(jù)分析簡介隨著第二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，海量數(shù)據(jù)不斷產(chǎn)生，包括大量的各類測序結(jié)果，需要憑借專業(yè)的人員和方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行各種分析和統(tǒng)計，才能得到有效的所需信息?；诔売嬎銠C(jī)、雄厚的生物信息學(xué)分析經(jīng)驗(yàn)與實(shí)力，欣景生物建立了成熟的高通量測序數(shù)據(jù)的分析流程，有著經(jīng)驗(yàn)豐富的生物信息學(xué)分析人員，可提供針對各類二代測序數(shù)據(jù)的深層數(shù)據(jù)分析服務(wù)。高通量測序數(shù)據(jù)分析服務(wù)適用范圍已進(jìn)行高通量測序?qū)嶒?yàn)的機(jī)構(gòu)，后續(xù)需要對所獲得的數(shù)據(jù)展開各種不同應(yīng)用的研究。如基因組數(shù)據(jù)挖掘、表達(dá)組的cSNP尋找、基因組的拼接與補(bǔ)洞、miRNA的不同樣本的表達(dá)差異分析等等。一般的二代測序服務(wù)公司沒有相應(yīng)深度分析的能力，而實(shí)驗(yàn)室很難獨(dú)立展開深度分析的工作，可以采用合作科研或純服務(wù)委托形式。我們提供的測序服務(wù)內(nèi)容（細(xì)致展開）表達(dá)組測序:特定組織或者細(xì)胞中的mRNA經(jīng)分離后制備成片段化的cDNA文庫，通過solexa測序儀對cDNA文庫高通量測序，從而獲得一個細(xì)胞或生物個體的全轉(zhuǎn)錄組信息。

miRNA測序:可對細(xì)胞或者組織中的全部SmallRNA進(jìn)行深度測序及定量分析等研究。用于作用靶基因的預(yù)測和鑒定、樣品間差異表達(dá)分析、miRNAs聚類和表達(dá)譜分析等科學(xué)應(yīng)用?；蚪M測序:細(xì)菌基因組測序:對全新或不同菌株細(xì)菌基因組進(jìn)行全測序研究。真菌全基因組測序(全新或不同菌株):對于真菌全基因組而言，可以得到到一個真菌基因組的精細(xì)圖（基因組覆蓋度大于95％，基因區(qū)覆蓋度達(dá)到98％以上，單堿基錯誤率低于十萬分之一）。全基因組重測序：全基因組重測序是對已知基因組序列的物種的個體進(jìn)行測序，并在個體或群體水平進(jìn)行差異分析的方法?；谌蚪M重測序的分子育種，能夠快速的進(jìn)行種質(zhì)資源普查篩選，尋找到大量基因差異，實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因的預(yù)測。在全基因組水平上掃描并檢測與動植物重要性狀相關(guān)的突變位點(diǎn)，具有重大的科研價值和產(chǎn)業(yè)價值。我們提供的數(shù)據(jù)分析服務(wù)（細(xì)致展開）基本數(shù)據(jù)分析：序列前處理工作，包括成對測序數(shù)據(jù)的序列匹配，裁減低質(zhì)量部分，數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換等序列拼接，Scaffolding，對454數(shù)據(jù)的homopolymer進(jìn)行修正等。用多種主流基因預(yù)測軟件預(yù)測基因并挑選最合適的代表基因結(jié)構(gòu)。tRNA/rRNA識別和分類?；蚪MGC含量分析，并識別特異區(qū)域。基因功能注釋（包括同源注釋和蛋白結(jié)構(gòu)域識別）?；蚬δ芊诸悾瑓⒄誈eneOntology或COG標(biāo)準(zhǔn)（由用戶指定標(biāo)準(zhǔn)）。

生物信息高級分析：提供圖型化界面由用戶人工確認(rèn)基因結(jié)構(gòu)和基因功能注釋。重復(fù)序列識別和分類。基因家族識別和聚類。基因功能聚類，參照FunCatDB標(biāo)準(zhǔn)。代謝調(diào)控途徑識別和重建。轉(zhuǎn)錄因子（TranscriptionFactor）識別和分類分析。分泌蛋白識別和分析。蛋白激酶識別和分析。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Transporter)識別和分析。假基因（pseudogene）識別和分析。SSR標(biāo)記模式識別和預(yù)測。更多相關(guān)內(nèi)容不再展開應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例高通量測序服務(wù)市場情況分析大型知名品牌企業(yè)：-華大基因。

-這類企業(yè)有完整的產(chǎn)業(yè)鏈，有著巨大規(guī)模的傳統(tǒng)測序與二代測序服務(wù)經(jīng)驗(yàn)與市場拓展經(jīng)驗(yàn)；但同時存在對具體客戶服務(wù)不夠細(xì)致的缺點(diǎn)。-2011年華大基因全球測序營業(yè)額1000000000元（人民幣）我們的優(yōu)勢1、服務(wù)水準(zhǔn)高。團(tuán)隊(duì)中有關(guān)高通量測序?qū)嶒?yàn)已經(jīng)大量大型課題的鍛煉，包括大量基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序等等，并已有Nature、Science等高端雜志文章數(shù)據(jù)分析經(jīng)驗(yàn)，有一整套嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和操作流程，且不斷跟蹤國際最新的進(jìn)展，可以在高起點(diǎn)為客戶提供服務(wù)。2、服務(wù)周到。技術(shù)團(tuán)隊(duì)中有專職的高通量數(shù)據(jù)信息分析人員，在測序完成后可以為客戶提供完整的生物信息學(xué)分析，直至可以進(jìn)行文章投稿或結(jié)題等，這點(diǎn)在各個高通量測序服務(wù)企業(yè)中是非常有優(yōu)勢的，因?yàn)楹芏嗫蛻魷y序完成后，如果缺乏此環(huán)節(jié)，其成果水平下降，甚至出現(xiàn)數(shù)據(jù)爛在手中的情況，并不是而事實(shí)上是因?yàn)槿狈Ψ治霏h(huán)節(jié)的保障。

3、服務(wù)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)操作階段的每個實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)都有專門的人員負(fù)責(zé)，有完善的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

4、服務(wù)靈活。針對客戶不同的需求在可行的前提下可以制定不同的實(shí)驗(yàn)操作與數(shù)據(jù)分析方案。

我們服務(wù)所提供的結(jié)果二代測序技術(shù)水平較高，且不同客戶需求不一致，以下只是基本的結(jié)果。（一）實(shí)驗(yàn)結(jié)果報告

建庫報告、測序報告。（二）實(shí)驗(yàn)流程報告（完整實(shí)驗(yàn)記錄）（三）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析報告（按不同應(yīng)用包括基因組拼接結(jié)果、轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析結(jié)果、miRNA種類與表達(dá)量等）（四）實(shí)驗(yàn)說明（所用儀器、試劑、耗材及分析軟件）我們所采用的設(shè)備IlluminagenomeanalyzerIIx價格：400萬Roche454價格：300-400萬數(shù)據(jù)分析服務(wù)一般流程數(shù)據(jù)質(zhì)量評價，對所需分析的高通量數(shù)據(jù)研究應(yīng)用分析，確定數(shù)據(jù)分析目標(biāo)與方案。計算處理，采用超級計算機(jī)對海量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果統(tǒng)計分析。附：Solexa–Illumina測序簡介2006年推出的IlluminaGenomeAnalyzer是一種基于單分子簇的邊合成邊測序技術(shù)，它基于專有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)原理。測序時將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flowcell上形成了數(shù)以億計Cluster，每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板DNA進(jìn)行測序。這種新方法確保了高精確度和真實(shí)的一個堿基接一個堿基的測序，排除序列方面的特殊錯誤，為同聚物和重復(fù)序列的測序提供了一個很好的解決方案。Solexa基因組測序簡要流程文庫制備：樣品收集，基因組DNA打斷，DNA末端修復(fù)，連接接頭DNA片段在ClusterStation上成簇擴(kuò)增：準(zhǔn)備Flowcell和試劑，安裝到ClusterStation；將樣品DNA連接到Flowcell；完全自動化完成Cluster制備DNA簇在GenomeAnalyzer上邊合成邊測序：Flowcell和試劑，安置到GenomeAnalyzer；全自動化完成測序，包括測序長Reads；圖片處理，實(shí)時分析，堿基識別；數(shù)據(jù)分析：組裝；變異分析；總結(jié)報告Solexaflowcell~50Mclustersaresequencedperflowcell.具體流程

2)將DNA片段通過接頭與flowcell的互補(bǔ)片段相連形成單鏈DNA模版，并經(jīng)過橋式PCR擴(kuò)增形成更多模版隨機(jī)打斷DNA并與接頭連接DebbieNickerson,DepartmentofGenomeSciences,UniversityofWashington,Solexa特點(diǎn)測序通量高：每個樣本測序可以提供500Mreads（1-1.5Gbp）數(shù)據(jù)，并可以根據(jù)客戶需求靈活對總量進(jìn)行調(diào)整準(zhǔn)確率高：同時也有效地解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題讀長已延長（單向>100bp）適合基因組重測序、表達(dá)譜、microRNA譜測序454測序流程

文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將基因組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，進(jìn)行生物素修飾及加接頭EmulsionPCR：特定比例的單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個獨(dú)特的單鏈DNA片斷磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。454測序流程測序反應(yīng)：乳液混合物被打破，擴(kuò)增后產(chǎn)生的幾百萬個相同的拷貝，被回收純化。攜帶DNA的珠子與其他反應(yīng)物混合物，隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個珠子（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，焦磷酸測序開始。每一個與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸的添加都會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號，并被CCD照相機(jī)所捕獲數(shù)據(jù)分析：GSFLX系統(tǒng)在10小時的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息，通過GSFLX系統(tǒng)提供兩