最全的動物疫病實驗室檢測方法

.最全常見疫病實驗室檢測方法目錄常見疫病實驗室檢測方法 1目錄 1常見ELISA操作方法 2亞洲1型口蹄疫抗體液相阻斷 ELISA檢測試劑盒 2豬瘟抗原檢測試劑盒 4豬瘟病毒抗體阻斷 ELISA試驗 10豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗 11口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白檢測方法（ 3ABC-I-ELISA） 12口蹄疫抗體液相阻斷-酶聯(lián)免疫吸附試驗 14PRRS抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗 17犬細小病毒抗體酶免測定試劑盒說明書 19犬瘟熱病毒抗體酶免測定試劑盒說明書 20常見PCR操作方法 22豬偽狂犬病毒PCR診斷試劑劑盒 22豬圓環(huán)病毒PCR診斷試劑盒 24常見RT-PCR操作方法 26口蹄疫病毒分子檢測診斷試劑盒 26H5亞型禽流感病毒RT-PCR檢測試劑盒說明書(20次) 28新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒 30豬瘟病毒RT-PCR診斷試劑盒 32凝集、血凝實驗操作方法 34弓形蟲間接血凝試驗(lHA)試劑使用說明書 34偽狂犬病乳膠凝集試驗試劑盒 35豬細小病毒病乳膠凝集試驗〈 LAT〉診斷試劑盒使用說明書 36豬傳染性萎縮性鼻炎乳膠凝集試驗〈 LAT〉操作程序 37豬瘟正向間接血凝試驗試劑使用說明書及實驗操作程序 38口蹄疫正向間接血凝試驗 40高致病性禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗程序 41瓊脂擴散試驗 43雞馬立克氏病 43禽流感瓊脂凝膠免疫擴散試驗 45熒光抗體檢測 46豬瘟熒光抗體試驗操作程序 46對狂犬病疑似動物腦組織的直接免疫熒光 (dFA)檢測 47血清學(xué)診斷檢測常用試劑配方 48禽流感HA和HI試驗用溶液的配制 48補充實驗 50豬流感病毒H1亞型Hl試驗抗原與陰、陽性血清說明書 501/60.豬流感病毒RT-PCR檢測..............................................................................................................52豬瘟病毒RT-PCR診斷試劑盒豬繁殖與呼吸綜合癥（Nsp21594~1680變異株）RT-PCR檢測實驗................................................................................................................................................54一、布魯氏菌病試管凝集試驗抗原與陰、陽性血清56二、布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗............................................................................................57動物結(jié)核病診斷操作規(guī)程............................................................................................................57常見ELISA操作方法亞洲1型口蹄疫抗體液相阻斷 ELISA 檢測試劑盒一試劑盒內(nèi)含物.說明書 亞洲1 型口蹄疫陽性對照血清 ( 己稀釋濃度為 1:8).96 孔ELISA 板 亞洲1 型口蹄疫陰性對照血清.液體稀釋槽 3% 雙氧水.U型96孔抗原抗體反應(yīng)板 25 ×PBST洗滌液(稀釋時準確量取 ).封板膜 豚鼠抗血清稀釋液.滅活亞洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原 (用冰決包裹 ) 終止液.亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清 包被緩沖液(碳酸鹽)膠囊.亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物(檸檬酸-磷酸鹽)緩沖液片劑.兔抗豚鼠血清 IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物 OPD 片劑二器材準備 ( 需用戶自備 )1.移液器:5-50μl移液器、0.2—10μl移液器、50—200μl移液器、50—300μl12道移液器各一把。移液槍尖(若干)?？乖贵w反應(yīng)板:微量血凝板(U型、V型均可)5塊,本試劑盒配備兩塊,用于被檢血清的稀釋和抗原抗體反應(yīng)。注:抗原抗體反應(yīng)板可重復(fù)使用,實驗后,用水沖洗干凈,然后用無離子水沸水浴 30秒,晾干,待用。超純水,無離子水或蒸餾水。三、試劑準備(需用戶完成)包被緩沖液(PH9.6)將本試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊 1粒小心打開,將膠囊內(nèi)粉末倒入 100ml無離子水中溶解即可。 4℃存放,1月內(nèi)有效。2. 洗滌液(PBST)將本試劑盒配備的 25 倍濃縮PBST液(可能有結(jié)晶形成 ,用時微熱溶化 )用無離子水或蒸餾水做 1:25稀釋。(如果PH降低,務(wù)必用NaOH調(diào)至7.4)底物溶液取1片檸檬酸—磷酸鹽片劑 (本試劑盒配備)溶于100mL無離子水中,溶化后,取50mL2/60.溶液, 再加1片鄰苯二胺(OPD)片劑,充分溶解,分裝（5mL/瓶或10Ml∕瓶), 避光之-2O℃保存。 用前避光溶化 ,臨時每1mL上述溶液加 10μL本試劑盒配備的 3%的雙氧水(H202)。務(wù)必加雙氧水!四、操作步驟用包被緩沖液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度(1:1000),在ELISA板上每孔加 50μl, 振蕩, 封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜?？乖贵w(陰陽性對照血清及待檢血清)反應(yīng)根據(jù)不同的需要,選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應(yīng)板上操作。圖196孔酶標板檢測10份樣品布局圖S1SSSSSSSSS1+1:32-1:41:82345678901:161：641:81:321：1281:641：2561:1281：5121:2561:10241:5121:20481:l021:40964圖1為抗體滴度測定(定量)檢測10份樣品布局圖;圖2為抗體滴度測定(定量)檢測20份樣品布局圖。圖296孔酶標板檢測20份樣品布局圖S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以圖1 為例, 在U型血凝板上按 50 μl/孔量用PBST將待檢 血清從1:4開始做2倍連續(xù)稀釋至 1:512。同時,按圖示稀釋陰陽性對照血清 , 然后每孔加入 50μl 用PBST稀釋到使用濃度的亞Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4, 即1份病毒抗原、加 3份PBST),病毒抗原對照孔加100μl。振蕩混勻,封板,4℃過夜。加入病毒抗原后血清的稀釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍稀釋。3/60.用洗滌液(1×PBST)洗ELISA板5次,在洗水紙上甩干,再將抗原抗體混合物從抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至ELISA板上的相對應(yīng)孔,每孔50μl封板,37℃溫育1小時。同上洗板5次,甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度 (1:1000), 每孔加50μl,封板,37℃溫育1小時。同上洗板5次,甩干。用l×PBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度(1:500), 每孔加50 μl封板,37 ℃溫育1 小時。同上洗板5次,每孔加50μl底物溶液(務(wù)必加雙氧水),37℃溫育15分鐘。每孔再加50μl終止液終止反應(yīng),立即在492nm波長下讀取光吸收值(OD492nm值)。五結(jié)果判定試驗認可標準每塊板設(shè)4孔病毒抗原對照,病毒抗原對照不加任何血清,直接用PBST稀釋至使用濃度,與血清/病毒抗原復(fù)合物同步加入ELISA板孔,50μl/孔,病毒抗原對照OD492nm值應(yīng)在1.5±0.5范圍內(nèi)。陽性對照抗體效價應(yīng)在1:1024±1滴度以內(nèi),陰性對照血清抗體效價應(yīng)＜1:8。病毒抗原對照平均OD492nm值50%計算(臨界值)抗原對照是4孔,棄去最高和最低 OD492nm值,計算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%對照值。該值即為臨界值，表示阻斷 50%反應(yīng)的對照OD492nm值。結(jié)果判定以病毒抗原對照平均OD492nm值的50%為臨界值,被檢血清稀釋孔OD492nm值大于臨界值的孔為陰性孔,小于或等于臨界值的孔為陽性孔,陽性孔的OD492nm值等于臨界值時所對應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均 OD492nm值為1.2,則其50%為0.60。若某一待檢血清在 1:128時OD492nm值為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為1:128。若臨界值處于兩個滴度之間,如處于1：64與1：128之間，則抗體滴度取中間值為1:9O。定性檢測中,兩個重復(fù)孔只要有一孔為陽性孔,則抗體滴度判定為1:128,兩孔均為陽性孔,則判定為抗體滴度＞1:128。ELISA抗體效價≥1:128,判定為亞洲 1 型口蹄疫抗體陽性。ELISA抗體效價與保護力的關(guān)系 :牛、羊:抗體效價≥1:128,99% 保護；效價≤1:16,不保護；效價在 1:22-90之間,50%保護。豬瘟抗原檢測試劑盒Classical Swine Fever Virus Antigen Test kit(CSFVAg)概 述豬瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒 (BVDV)、邊界病病毒 (BDV)都是瘟病毒科黃病毒屬的成員。豬瘟病毒自從成為一種重要的病原體以來， 給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失， 并引起豬的嚴重死亡。感染高致病力豬瘟病毒后， 豬在出現(xiàn)臨床癥狀前會排出大量的病毒。耐過急性4/60.或亞急性感染的動物會產(chǎn)生抗體并且不再散毒 。低致病力溫和病毒會造成豬的隱性感染， 病豬將會持續(xù)或間歇排出病毒直至死亡。懷孕母豬與豬瘟病毒接觸后可能通過胎盤感染胎兒。先天性感染可能導(dǎo)致流產(chǎn)，木乃伊胎兒，死產(chǎn)和 /或弱仔及畸形胎兒。先天性感染低毒力病毒的結(jié)果是產(chǎn)出持續(xù)性感染的仔豬，仔豬出現(xiàn)免疫耐受，不表現(xiàn)任何癥狀向外排毒。豬也有可能感染 BVDV或BDV。盡管這些感染通常呈溫和經(jīng)過并且是自限性的， 但將它們同豬瘟病毒有效區(qū)分是很重要的。原 理本ELISA檢測試劑盒是用來檢測外周血白細胞、全血、細胞培養(yǎng)物以及組織樣本中的豬瘟病毒抗原。采用雙抗體夾心ELISA，將CSFV單克隆抗血清包被微量反應(yīng)板，可與樣品中的CSEV抗原結(jié)合。豬瘟病毒的特異性單克隆抗體形成了夾心的上層。形成的單克隆抗體 +樣品+單克隆抗體夾心可以用辣根過氧化物酶標記物檢測。加入與辣根過氧化物酶反應(yīng)的底物，在酶的作用下形成有色產(chǎn)物。通過酶標儀測定其吸光度?？梢杂?450nm單波長或450nm與620m雙波長測定各孔吸光度。試 劑本試劑盒采用 96孔板，可以一次檢測 92個樣品(每個樣品1孔，每個對照2孔)或46個樣品(每個樣品2孔，每個對照2孔)；或分6次使用，每次用2個板條，設(shè)2個對照，測定6個樣品(每個樣品2孔)。為了檢測結(jié)果的準確性，最好每個樣本都設(shè)重復(fù)。試 劑 數(shù) 量1、多克隆羊抗血清包被板條 8孔×12條(96孔)2、10倍濃縮樣品稀釋液 (10x) 55ml足以配制550mL直接使用的1x稀釋液3、10倍濃縮洗滌液 (10x) 125ml足以配制1、25L直接使用的洗滌液工作濃度 (1x)4、CSFV單克隆抗體，含防腐劑 4ml5、陽性對照，含有防腐劑 1.5ml6、陰性對照，含有防腐劑 1.5ml7、100倍濃縮辣根過氧化物酶標記物 (100x)，辣根過氧化物酶標記抗鼠 IgG，含有防腐劑 200μl8、酶標抗體稀釋液 15ml9、底物液，TMB/H2O2溶液 12ml10、終止液，1MHCI(小心，強酸) 12ml5/60.注意事項1、仔細閱讀并遵守操作說明；2、試劑盒試劑于 2～7℃冷藏保存。建議將濃縮的洗滌液 (10x)保存在18～25℃室溫，以免形成結(jié)晶。3、所有試劑在使用前必須恢復(fù)至室溫。4、未使用的包被板應(yīng)該密封保存在配備的塑料袋中，于 2～7℃冷藏保存。5、不要將不同批次的說明書以及試劑盒成分混合使用。6、注意防止真菌或細菌污染試劑盒成分。處理試劑時要小心。7、不要用超過保質(zhì)期的檢測試劑盒。8、進行樣品或試劑操作時嚴禁吃東西、喝水或吸煙。9、每個樣品都用單獨的吸頭。10、每一批次的試劑必須用其配備的陰陽對照。11、配制試劑時只能用超純水。12、不要用嘴吸取液體。13、底物溶液和濃縮的樣本稀釋液對眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚有剌激性，避免與皮膚和眼睛接觸。14、終止液為1MHCl，HCI為強酸并且能造成灼傷，小心處理。15、本試劑盒只能用于體外診斷。獸醫(yī)專用。試劑配制1、包被的反應(yīng)板、豬瘟病毒特異性單克隆抗體、陽性對照、陰性對照、底物溶液、終止液為現(xiàn)用試劑。2、洗滌液10倍濃縮洗滌液必須用超純水或雙蒸水進行 10倍(1：10)稀釋，稀釋的洗滌液于 2～7℃冷藏保存，但不能超過 3天；或冰凍保存，至少可以保存一年。例如：配制 500ml稀釋的洗滌液，將450ml超純水或雙蒸水加到 50ml濃縮液中，混勻。注意：如果濃縮液有結(jié)晶，在使用前必須溶解。可將瓶子放在溫水中 30分鐘以上。3、樣品稀釋液10倍濃縮樣品稀釋液必須用超純水或雙蒸水進行 10倍(1∶10)稀釋，但如果檢測全血樣品時，將適量的 10倍濃縮液與等體積的超純水混合，制成 5倍濃縮液(5X)即可。將制備的稀釋液于2～7℃冷藏保存，但不能超過 3天；或者冰凍保存，可以保存一年以上。6/60.4、辣根過氧化物酶標記物 (100x)100倍(100X)濃縮標記物在使用前必須用標記物稀釋液進行 1∶100倍稀釋。如果只使用部分試劑，只要用稀釋液按 100倍(1∶100)稀釋足夠本次使用的標記物濃縮液 (旋渦振蕩混勾 )即可。稀釋后的標記物溶液只能保存 24小時。例如：10ml的辣根過氧化物酶標記物工作液，只需取100μl濃縮標記物(100X)加到10ml標記物稀釋液中，在旋渦振蕩器上混勻即可。自備器材1、精密移液器， 5μ1至1000μ12、一次性移液吸頭。3、雙蒸水或超純水。4、洗瓶或自動洗板機。5、濕盒或封板膠帶。6、離心機，2000xg。7、酶標儀。8、離心管和小試管。9、微量離心機， 10，000xg。10、旋渦振蕩器。11、剪刀和攝子。12、0.17MNH4CI溶液，制備白細胞用。樣品制備注意：制備好的樣品或組織可以在 2～7℃保存7天，或-20℃冷凍保存6個月以上。但這些樣品在應(yīng)用前應(yīng)該再次以 1，500xg離心10分鐘或10，000xg離心2～5分鐘。外周血白細胞取10ml肝素或EDTA抗凝血樣品，1，500xg離心15～20分鐘。用移液器小心吸出血沉棕黃層，加入500μl樣品稀釋液(1X)，在旋渦振蕩器上混勻，室溫下放置1小時，其間不時用旋渦器混合。然后直接進行步驟f操作；c)假如樣品的棕黃層壓積細胞體積非常少，那么就用整個細胞團(包括紅細胞)。將細胞加進10ml的離心管，并加入5ml預(yù)冷(2～7℃，下同)的0.17MNH4CI(氯化銨)混勻，靜置10分鐘。用冷(2～7℃)超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1，500xg離心5分鐘。棄去上清，向細胞團中加入500μl樣品稀釋液(1x)，用潔凈的吸頭懸起細胞，在旋渦振蕩器上混勻，室溫放置1小時。期間不時用旋渦器混合。7/60.1，500xg離心5分鐘，取上清液按"操作步驟"進行檢測。注意：處理好的樣品可以在2～7℃冷藏保存7天，或-20℃冷凍保存6個月，但在使用前必須再次離心。外周血自細胞 (簡化方法)a)取0.5～2ml肝素或EDTA抗凝血與等體積冷 (2-8℃)0.17MNH4CI加入離心管混合。室溫放置10分鐘。b)1，500xg離心10分鐘(或10，000xg離心2－3分鐘)，棄掉上清。c)用冷(2～7℃)超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻， 1，500xg離心5分鐘。d)棄去上清，向細胞團中加入 500μl樣本稀釋液(1x)。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置 1小時。期間不時用旋渦器混合。取 75μl按照"操作步驟"進行檢測。全血(肝素或EDTA抗凝)a)取25μl10倍濃縮樣品稀釋液 (10X)和475μl全血加入微量離心管，在旋渦振蕩器上混勻。室溫下溫育1小時，期間不時用旋渦器混合。此樣品可以直接按照“操作步驟”進行檢測。或：直接將75μl全血加入酶標板孔中，再加入 10μl5倍濃縮樣品稀釋液 (5X)?；蝿用笜税?板條，使樣品混合均勻。再按照“操作步驟”進行檢測。細胞培養(yǎng)物移去細胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)瓶中的細胞加入到離心管中。2，500xg離心5分鐘，棄去上清。向細胞團中加入500μl樣品稀釋液(1x)。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置1小時。期間不時用旋渦器混合。取此樣品 75μl按照“操作步驟”進行檢測。組織最好用新鮮的組織。如果有必要，組織可以在處理前于 2～8℃冷藏保存1個月。每只動物檢測1～2種組織，最好選取扁桃體、脾、腸、腸系膜淋巴結(jié)或肺。a)取1～2g組織用剪刀剪成小碎塊 (2～5mm大小)。將組織碎塊加入10ml離心管，加入5ml樣品稀釋液(1x)，旋渦振蕩混勻，室溫下放置1～2小時，期間不時用旋渦器混合。1，500xg離心10分鐘，取75μl上清液按照“操作步驟”進行檢測。操作步驟注意：所有試劑在使用前應(yīng)該恢復(fù)至室溫18～25℃；使用前試劑應(yīng)在室溫條件下至少放8/60.置1小時。1、每孔加入25μlCSFV特異性單克隆抗體。此步驟可以用多道加樣器(8～12道)操作。2、在相應(yīng)孔中分別加入75μl陽性對照、陰性對照，各加2孔。注意更換吸頭。3、在其余孔中分別加入75μl制備好的樣品，注意更換吸頭。輕輕拍打酶標板，使樣品混合均勻。4、置濕盒中或用膠條密封后室溫 (18～25℃)溫育過夜。也可以放置室溫溫育 4個小時，但是這可降低檢測靈敏度。5、甩掉孔中液體，用洗滌液 (1X)洗滌5次，每次洗滌都要將孔注滿。將孔中的所有液體倒空，用力拍打酶標板，以使所有液體拍出。或者，每孔加入洗滌液 250～300μl用自動洗板機洗滌5次。注意：洗滌酶標板要仔細細心。6、每孔加入100μl稀釋好的辣根過氧化物酶標記物 ，在濕盒或密封后置室溫溫育 1小時。7、重復(fù)操作步驟 5；每孔加入100μl底物液，在暗處室溫溫育 10分鐘。第1孔加入底物液開始計時。8、每孔加入100μl終止液終止反應(yīng)。加入終止液的順序與上述加入底物的順序一致。9、在酶標儀上測量樣品與對照孔在 450m處的吸光值，或測量在 450nm和620nm雙波長的吸光值(空氣調(diào)零)。10、計算每個樣品和陽性對照孔的矯正吸光值的平均值 (參見“計算方法” )。計算方法首先計算樣品和對照孔的OD平均值，在判定結(jié)果之前，所有樣品和陽性對照孔的OD平均值必須進行矯正，矯正的OD值等于樣本或陽性對照值減去陰性對照值。矯正OD=樣本OD－陰性對照OD注意：北京愛德士元亨生物科技有限公司奮進行平均值相 UN值計算并提供數(shù)據(jù)匯總的儀器和軟件系統(tǒng) (xChek)試驗有效性判定陽性對照OD平均值應(yīng)該大于 0.500，陰性對照OD平均值應(yīng)小于 0.150，試驗結(jié)果方能有效。否則，應(yīng)仔細檢查實驗操作并進行重測。如果陰性對照的吸收值始終很高，將陰性對照液在微量離心機中 10，000xg離心3～5分鐘，重新檢測。結(jié)果判定被檢樣品的矯正吸光值大于或等于 0.30，則為陽性：被檢樣品的矯正吸光值小于 0.20，則為陰性；被檢樣品的矯正吸光值大于 0.20，小于0.30，則為可疑。9/60.建議根據(jù)外周血白細胞處理方案或細胞培養(yǎng)物處理方案進行全血樣品的處理和檢測。豬瘟病毒抗體阻斷 ELISA試驗本方法是用于檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體的一種阻斷 ELISA方法，通過待測抗體和單克隆抗體與豬瘟病毒抗原的競爭結(jié)合， 采用辣根過氧化物酶與底物的顯色程度來進行判定。1 操作步驟在使用時，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到室溫 18～25℃。使用前應(yīng)將各組分放置于室溫至少 1小時。1.1 分別將50uL樣品稀釋液加入每個檢測孔和對照孔中。1.2 分別將50uL的陽性對照和陰性對照加入相應(yīng)的對照孔中，注意不同對照的吸頭要更換，以防污染。1.3 分別將50uL的被檢樣品加入剩下的檢測孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開，以防污染。1.4輕彈微量反應(yīng)板或用振蕩器振蕩，使反應(yīng)板中的溶液混勻。1.5將微量反應(yīng)板用封條封閉置于濕箱中（18～25℃）孵育2小時，也可以將微量反應(yīng)板用封條置于濕箱中孵育過夜。1.6吸出反應(yīng)孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3次，注意每次洗滌時都要將洗滌液加滿反應(yīng)孔。1.7 分別將100uL的抗CSFV酶標二抗（即取即用）加入反應(yīng)孔中，用封條封閉反應(yīng)板并于室溫下或濕箱中孵育 30分鐘。1.8 洗板（見1.6）后，分別將 100uL的底物溶液加入反應(yīng)孔中，于避光、室溫條件下放置10分鐘。加完第一孔后即可計時。1.9 在每個反應(yīng)孔中加入 100uL終止液終止反應(yīng)。注意要按加酶標二抗的順序加終止液。1.10 在450nm處測定樣本以及對照的吸光值， 也可用雙波長 (450nm和620nm)測定樣本以及對照的吸光度值，空氣調(diào)零。1.11 計算樣本和對照的平均吸光度值。計算方法如下：計算被檢樣本的平均值 OD450（＝ODTEST）、陽性對照的平均值（＝ODPOS）、陰性對照的平均值（＝ODNEG）。根據(jù)以下公式計算被檢樣本和陽性對照的阻斷率；ODNEG-ODTEST10/60.阻斷率＝ ——————— ×100%ODNEG2試驗有效性陰性對照的平均 OD450應(yīng)大于0.50。陽性對照的阻斷率應(yīng)大于 50%。3 結(jié)果判定如果被檢樣本的阻斷率大于或等于 40％，該樣本被判定為陽性 （有CSFV抗體存在）。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于 30％，該樣本被判定為陰性（無 CSFV抗體存在）。如果被檢樣本阻斷率在 30～40％之間，應(yīng)在數(shù)日后再對該動物進行重測。豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗（一）材料及試劑1．豬瘟單抗純化抗原2．兔抗豬 IgG酶標抗體3．豬瘟陽性血清4．豬瘟陰性血清1～4均由指定的生物制品所購買。5．ELISA反應(yīng)板6．包被液碳酸鈉1.50g碳酸氫鈉2.93gH2O加至1000mlpH值9.67．PBS液氯化鈉8.90g、磷酸二氫鉀0.20g、無水磷酸氫二鈉2.13g、加雙餾水1000ml8．PBS－吐溫洗滌液、PBS液1000ml、犢牛血清5ml、混合即可9．底物溶液⑴0.1Mol/L檸檬酸液、檸檬酸21g、雙蒸餾水加至1000ml⑵0.2Mol/LNa2HPO4液、Na2HPO4·12H2O71.6g、雙蒸餾水加至1000ml⑶pH5.0磷酸鹽－檸檬酸緩沖液?、乓?24.30ml、⑵液 25.70ml混勻即可⑷鄰苯二胺液取⑶液 50ml、雙餾水 50ml、磷苯二胺 20mg、30%H2O20.15ml，待鄰苯二胺溶化后再加H2O2，現(xiàn)用現(xiàn)配。10．終止液11/60.濃H2SO4(98%)22.2ml、H2O177.80ml（二）操作方法1．用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強毒單抗純化酶聯(lián)抗原各做100倍稀釋，每孔包被 100μl，4℃濕盒過夜。2．次日取出，甩去孔內(nèi)液體， 3×3′沖洗。3．將待檢血清以 PBS液做400倍稀釋，每孔加 100μl同時將豬瘟陽性血清、豬瘟陰性血清各做 100倍稀釋，于對照孔中加 100μl。37℃溫育1.5h～2h。4．重復(fù)第二步，取出，甩去孔內(nèi)液體， 3×3′洗滌。5．將兔抗豬 IgG酶標抗體以 PBS液做100倍稀釋，每孔加100μl，37℃溫育1.5h～2h。6．重復(fù)第 4步。7．每孔加底物溶液 100μl，室溫下觀察顯色反應(yīng)。當陰性對照孔稍顯色時，立即終止反應(yīng)，并以陰性孔做空白對照。8．每孔加終止液 50μl立即于酶聯(lián)免疫吸附檢測儀測定 490nm波長的光密度。（三）結(jié)果判定在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上， OD≥0.2，為豬瘟弱毒抗體陽性； OD＜0.2，為豬瘟弱毒抗體陰性。在豬瘟強毒酶聯(lián)板上， OD≥0.5，為豬瘟強毒抗體陽性； OD＜0.2，為豬瘟強毒抗體陰性?？谔阋呓Y(jié)構(gòu)蛋白檢測方法（ 3ABC-I-ELISA）簡介口蹄疫(FMD)是一種高度接觸性傳染病，傳播迅速，可形成世界性大流行，對養(yǎng)殖業(yè)和國際畜產(chǎn)品貿(mào)易具有嚴重的負面影響?？刂坪拖麥?FMD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群。在采用疫苗的國家，大多數(shù)動物血清口蹄疫病毒 (FMDV)結(jié)構(gòu)蛋白和病毒感染相關(guān)抗原(VIAA，即3D)抗體均為陽性，因此，一些基于結(jié)構(gòu)蛋白和 VIAA的診斷方法很難確定口問疫病毒感染與否 。只有將感染動物和隱性帶毒動物與疫苗免疫動物加以區(qū)分才能為FMD的控制和消滅提供科學(xué)的依據(jù)。日前的疫苗生產(chǎn)工藝，在病毒純化過程中去除絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白， 因此滅活疫苗免疫動物體內(nèi)沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 3ABC抗體產(chǎn)生，而自然感染動物體內(nèi)既有結(jié)構(gòu)蛋白抗體 ，也有非結(jié)構(gòu)蛋向 3ABC抗體。因此檢測FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的ELISA方法不但可以檢測隱性感染動物，而且可以區(qū)分感染動物和免疫動物?？谔阋卟《痉墙Y(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測試劑盒 (FMD3ABC-I-ELlSA)對感染牛的檢出率很12/60.高，敏感性在 99%以上。對免疫牛的特異性在 96%以上。用途FMD3ABC-I-ELISA試劑盒檢測FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體。該試劑盒不受血清型影響，適用于活畜進出口調(diào)運、疫區(qū)凈化檢疫和群體無癥狀感染評價，區(qū)分感染和免疫動物。原理FMD3ABC-I-ELISA試劑盒采用間接 ELISA模式。用3ABC基因表達蛋白（ Ag）包被ELISA板，洗板封閉。檢測時，加入待檢血清樣品，如果血清樣品中有 3ABC抗體，與ELISA板上3ABC蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，再與酶標二抗結(jié)合，加入底物后，就會出現(xiàn)顏色反應(yīng)。如果待檢樣品為陰性，就不能形成抗原-抗體復(fù)合物，酶標二抗不會結(jié)合，因此就不顯色。注意事項1．冰凍血清樣品應(yīng)充分融化，且應(yīng)混和均勻。2．血清稀釋液和底物應(yīng)平衡至室溫應(yīng)用。底物A在4℃為結(jié)晶狀態(tài)，需要在室溫或37℃水浴化開后應(yīng)用。3．最好在血清稀釋板上稀釋血清，以減小操作誤差。4．應(yīng)使用相同的加樣器加樣，以保證加樣量的準確，減小試驗誤差。5．多道微量移液器所用的吸頭應(yīng)為同一規(guī)格和型號，避免加樣誤差。6．應(yīng)使用自動或手動連續(xù)洗板系統(tǒng)洗板。7．加樣先后次序應(yīng)該一致，保證作用時間一樣。8．底物作用時間到后，如果顏色較淺，可適當延長作用時間。9．本試劑盒只能檢測一種動物的血清樣本，應(yīng)分別訂購檢測牛、豬或羊血清的試劑盒，以測定不同動物來源的血清。試劑準備l.洗滌液(PBST)將試劑盒配備的25倍濃縮PBST用無離子水或蒸餾水做l:25倍稀釋即可。操作步驟1.待檢血清樣品和陽性、陰性對照血清用血清稀釋液1:2l倍稀釋(120μL血清稀釋液加血清6μL)，每孔加入lOOμL，陰、陽性對照血清平行加兩孔，用封口膜封口， 37℃結(jié)合30分鐘。2. 取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌 5次，最后一次拍干。用血清稀釋液按l:lOO比例稀釋酶標二抗，每孔加入100μL，用封口膜封口，37℃結(jié)合30分鐘。4. 取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌 5次，最后一次拍干。將底物A按1:50比例(體積比)稀釋于底物B中(lmL底物B中加入2OμL底物A)，吹打混勻，每孔加入lOOμL，封口膜封口，37℃避光作用10～15分鐘。每孔加入.100μL終止液。13/60.輕輕搖振混勻，測定波長450nm吸光值(OD450nm值)。陽性對照平均OD值應(yīng)大于0.6；陰性對照平均OD值應(yīng)小于0.2。結(jié)果計算:樣品效價為:(OD樣品-OD陰性)÷(OD陽性-OD陰性)。結(jié)果判定若效價<0.2，為陰性；效價在0.2～0.3之間為可疑；效價>0.3為陽性。可疑和陽性樣品應(yīng)進行復(fù)測，復(fù)測為可疑或者陽性時，應(yīng)判為陽性。口蹄疫抗體液相阻斷-酶聯(lián)免疫吸附試驗一試劑盒內(nèi)含物.說明書 亞洲1 型口蹄疫陽性對照血清 ( 己稀釋濃度為 1:8).96 孔ELISA 板 亞洲1 型口蹄疫陰性對照血清.液體稀釋槽 3% 雙氧水.U型96孔抗原抗體反應(yīng)板 25 ×PBST洗滌液(稀釋時準確量取 ).封板膜 豚鼠抗血清稀釋液.滅活亞洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原 (用冰決包裹 ) 終止液.亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清 包被緩沖液(碳酸鹽)膠囊.亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清 底物(檸檬酸-磷酸鹽)緩沖液片劑.兔抗豚鼠血清 IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物 OPD 片劑二器材準備 ( 需用戶自備 )1.移液器:5-50μl移液器、0.2—10μl移液器、50—200μl移液器、50—300μl1214/60.道移液器各一把。移液槍尖(若干)。抗原抗體反應(yīng)板:微量血凝板(U型、V型均可)5塊,本試劑盒配備兩塊,用于被檢血清的稀釋和抗原抗體反應(yīng)。注:抗原抗體反應(yīng)板可重復(fù)使用,實驗后,用水沖洗干凈,然后用無離子水沸水浴 30秒,晾干,待用。超純水,無離子水或蒸餾水。三、試劑準備(需用戶完成)包被緩沖液(PH9.6)將本試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊 1粒小心打開,將膠囊內(nèi)粉末倒入 100ml無離子水中溶解即可。 4℃存放,1月內(nèi)有效。2. 洗滌液(PBST)將本試劑盒配備的25倍濃縮PBST液(可能有結(jié)晶形成,用時微熱溶化)用無離子水或蒸餾水做1:25稀釋。(如果PH降低,務(wù)必用NaOH調(diào)至7.4)3.底物溶液取1片檸檬酸—磷酸鹽片劑 (本試劑盒配備)溶于100mL無離子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片鄰苯二胺(OPD)片劑,充分溶解,分裝（5mL/瓶或10Ml∕瓶), 避光之-2O℃保存。 用前避光溶化 ,臨時每1mL上述溶液加 10μL本試劑盒配備的 3%的雙氧水(H202) 。務(wù)必加雙氧水。四、操作步驟用包被緩沖液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度(1:1000),在ELISA板上每孔加 50μl, 振蕩, 封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。抗原抗體(陰陽性對照血清及待檢血清)反應(yīng)根據(jù)不同的需要,選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應(yīng)板上操作。圖196孔酶標板檢測10份樣品布局圖S1SSSSSSSSS1+1:32-1:41:82345678901:161：641:81:321：1281:641：25615/60.1:1281：5121:2561:10241:5121:20481:l021:40964圖1為抗體滴度測定(定量)檢測10份樣品布局圖;圖2為抗體滴度測定(定量)檢測20 份樣品布局圖。圖296孔酶標板檢測20份樣品布局圖S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以圖1 為例, 在U型血凝板上按 50 μl/孔量用PBST將待檢 血清從1:4開始做2倍連續(xù)稀釋至 1:512。同時,按圖示稀釋陰陽性對照血清 , 然后每孔加入 50μl 用PBST稀釋到使用濃度的亞Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4, 即1份病毒抗原、加 3份PBST),病毒抗原對照孔加 100μl。振蕩混勻,封板,4℃過夜。加入病毒抗原后血清的稀釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍稀釋。用洗滌液(1×PBST)洗ELISA板5次,在洗水紙上甩干,再將抗原抗體混合物從抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至ELISA板上的相對應(yīng)孔,每孔50μl封板,37℃溫育1小時。同上洗板5次,甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度 (1:1000), 每孔加50μl,封板,37℃溫育1小時。同上洗板5次,甩干。用l×PBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度(1:500),每孔加50μl封板,37℃溫育1小時。6.同上洗板5次,每孔加50μl底物溶液(務(wù)必加雙氧水),37℃溫育15分鐘。每孔再16/60.加50μl終止液終止反應(yīng) ,立即在492nm波長下讀取光吸收值 (OD492nm值)。五結(jié)果判定試驗認可標準每塊板設(shè)4孔病毒抗原對照,病毒抗原對照不加任何血清,直接用PBST稀釋至使用濃度,與血清/病毒抗原復(fù)合物同步加入ELISA板孔,50μl/孔,病毒抗原對照OD492nm值應(yīng)在1.5±0.5范圍內(nèi)。陽性對照抗體效價應(yīng)在1:1024±1滴度以內(nèi),陰性對照血清抗體效價應(yīng)＜1:8。病毒抗原對照平均OD492nm值50%計算(臨界值)抗原對照是4孔,棄去最高和最低 OD492nm值,計算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%對照值。該值即為臨界值，表示阻斷 50%反應(yīng)的對照OD492nm值。結(jié)果判定以病毒抗原對照平均OD492nm值的50%為臨界值,被檢血清稀釋孔OD492nm值大于臨界值的孔為陰性孔,小于或等于臨界值的孔為陽性孔,陽性孔的OD492nm值等于臨界值時所對應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均 OD492nm值為1.2,則其50%為0.60。若某一待檢血清在 1:128時OD492nm值為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為1:128。若臨界值處于兩個滴度之間,如處于1：64與1：128之間，則抗體滴度取中間值為1:9O。定性檢測中,兩個重復(fù)孔只要有一孔為陽性孔,則抗體滴度判定為1:128,兩孔均為陽性孔,則判定為抗體滴度＞1:128。ELISA抗體效價≥1:128,判定為亞洲 1 型口蹄疫抗體陽性。ELISA抗體效價與保護力的關(guān)系 :牛、羊:抗體效價≥1:128,99% 保護；效價≤1:16,不保護；效價在 1:22-90之間,50%保護。PRRS抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗1、試劑的準備所有的試劑在使用前，必須回溫到室溫。洗液（10x）：1份清洗液加入到 9份滅菌水或去離子水中， 7天內(nèi)用完。清洗液使用前搖勻溶解。樣本稀釋液（3x）：1體積的樣稀釋液中加入 2體積的蒸餾水或去離子水， 2天內(nèi)用完。2、樣本的準備17/60.陽性對照，陰性對照不必稀釋，樣本用樣本稀釋液 200倍稀釋，稀釋方法：取 5μl的樣本加入 95μl的樣本稀釋液，再取稀釋了 20倍的液體5μl加入到ELISA反應(yīng)孔中，再加入45μl的樣本稀釋液。3、操作步驟將樣本和對照加入到板孔中。陽性對照和陰性對照必須是雙份。1. 加入50μl陽性和陰性對照，及 200倍稀釋的樣品在反應(yīng)板孔。蓋上膜，在37℃作用60分鐘。去膜，用300μl的洗液洗3遍，并在吸水紙上將平板弄干（顛倒，在紙上輕敲）在每個空中加入50μl的酶標抗體。蓋上膜在37℃作用60分鐘。去膜，用300μl的洗液洗3遍，弄干。加入50μl的底物，輕搖板2次。將平板放在黑暗中在20-25℃作用10分鐘。加入50μl終止液，輕敲平板混勻。用柔軟的東西輕拭平板上的贓物，在450nm下讀數(shù)并記錄結(jié)果。讀數(shù)A．實驗成立條件陽性對照的平均值 OD450>0.6，而且陽性對照平均值 /陰性對照平均值 >4.0.結(jié)果的稀釋結(jié)果用IRPC表示，以下是計算公式(OD450樣品-OD450陰性對照平均值)IRPC＝[————————————————]×100ODNEGIRPCPRRS抗體說明小于或者等于20.0陰性大于20.0陽性18/60.犬細小病毒抗體酶免測定試劑盒說明書原理：本試劑盒采用間接 ELISA方法檢測犬血清中犬細小病毒 IgG抗體。在聚苯乙烯微孔酶標板上,包被純化的犬細小病毒抗原。待檢血清中的CPV抗體與包被抗原特異結(jié)合,再與HRP標記的兔抗犬IgG抗體結(jié)合,形成抗原－抗體－酶標抗體復(fù)合物,加TMB底物作用顯色,在酶標儀上測定OD值判定結(jié)果。試劑盒的組成(96頭份):1.CPV抗原反應(yīng)板12*8孔2.20倍濃縮洗液30ml*1瓶3、樣品稀釋液15mI*1瓶4、CPV陰性對照300μL*1支5、CPV陽性對照300μL*1支6、50倍CPV酶結(jié)合物液300μL*l支7、酶結(jié)合物稀釋液15ml*1瓶8、底物液A8ml*1瓶9.底物液B8ml*1瓶10、終止液8ml*1瓶11、封板膜2張12、自封袋1個13、說明書1張試劑準備:將20倍濃縮洗液用蒸餾水稀釋20倍后備用(30ml濃縮洗液+570ml蒸餾水)。2.將50倍CPV酶結(jié)合物液用酶結(jié)合物稀釋液稀釋 50倍后備用(300u150倍CPV酶結(jié)合物液+15m1酶結(jié)合物稀釋液),輕振混勻,當日用完。操作步驟:1.待檢血清在板孔外用稀釋后的洗滌液作l:16倍預(yù)稀釋(150uL洗滌液+10uL待檢血清)備用。陰、陽性對照不稀釋。記下稀釋樣品的對應(yīng)編號,每次試驗設(shè)陽性對照、陰性對照、各2孔。試劑盒平衡至室溫,在反應(yīng)板各孔中加入100uL樣品稀釋液。再分別在相應(yīng)孔中加入經(jīng)預(yù)稀釋的待檢血清 1OuL,然后在對照孔中分別加入 10uL陰、陽性對照。充分混勻后 ,貼上封板膜,置37℃溫育20分鐘。4.小心揭掉封板膜 ,棄去各孔中液體、拍干。每孔加滿洗滌液 ,靜置約30秒,如此重復(fù)洗滌5次,最后一遍拍干。每孔加入經(jīng)過稀釋的酶結(jié)合物液100uL,貼上封板膜,置37℃溫育20分鐘。操作同步驟5。每孔加入底物液A50uL,再加入底物液B50uL,輕拍混勻,置37℃避光顯色10分鐘。19/60.每孔加入終止液50uL,輕輕振蕩,置酶標儀450nm波長處測定OD值。要求:陽性對照OD值有效范圍:≥0.60。陰性對照OD值有效范圍:≤0.10(陰性對照若有一孔大于0.10應(yīng)舍棄,如果兩孔OD值都大于0.10,應(yīng)重復(fù)試驗)。結(jié)果判定:1.臨界值(CutOff 值)的計算:CutOff 值=(陽性對照OD平均值一陰性對照 OD平均值)×0.1+陰性對照OD平均值待檢樣本OD值≥臨界值(CutOff值)即判為CPV抗體具有保護效價:小于臨界值(CutOff值)即判為CPV抗體未達到保護效價。注意事項:1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)置室溫平衡后再打開密封袋 ,未用完的微孔反應(yīng)板條用自封袋加干燥劑保存。各步加液均應(yīng)使用加液器并經(jīng)常校對其準確性,以減少實驗誤差。洗滌時各孔均需加滿洗滌液,防止因洗滌不充分造成非特異性顯色。封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準,且終止反應(yīng)后應(yīng)在10分鐘以內(nèi)測定其OD值。所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。不同批次試劑不能混用。請嚴格按說明書操作。犬瘟熱病毒抗體酶免測定試劑盒說明書原理本試劑盒采用間接 ELISA方法檢測犬血清中犬瘟熱病毒 IgG抗體。在聚苯乙烯微孔酶標板上,包被純化的犬瘟熱病毒抗原。待檢血清中的CDV抗體與包被抗原特異結(jié)合,再與HRP標記的兔抗犬IgG抗體結(jié)合,形成抗原－抗體－酶標抗體復(fù)合物,加TMB底物作用顯色,在酶標儀上測定OD值判定結(jié)果。試劑盒的組成(96頭份):1、CDV抗原反應(yīng)板12*8孔2、20倍濃縮洗液30ml*1瓶3、樣品稀釋液15mI*1瓶4、CDV陰性對照300μL*1支5、CDVF陽性對照300μL*1支6、50倍CDV酶結(jié)合物液300μL*l支7、酶結(jié)合物稀釋液 15ml*1 瓶8、底物液A 8ml*1 瓶9.底物液B 8ml*1 瓶20/60.10、終止液8ml*1瓶11、封板膜2張12、自封袋1個13、說明書1張試劑準備:將20倍濃縮洗液用蒸餾水稀釋20倍后備用(30ml濃縮洗液+570ml蒸餾水)。2.將50倍CDV酶結(jié)合物液用酶結(jié)合物稀釋液稀釋 50倍后備用(300u150倍CDV酶結(jié)合物液+15m1酶結(jié)合物稀釋液),輕振混勻,當日用完。操作步驟:1.待檢血清在板孔外用稀釋后的洗滌液作l:16倍預(yù)稀釋(150uL洗滌液+10uL待檢血清)備用。陰、陽性對照不稀釋 。記下稀釋樣品的對應(yīng)編號,每次試驗設(shè)陽性對照、陰性對照、各2孔。試劑盒平衡至室溫,在反應(yīng)板各孔中加入100uL樣品稀釋液。再分別在相應(yīng)孔中加入經(jīng)預(yù)稀釋的待檢血清 1OuL,然后在對照孔中分別加入 10uL陰、陽性對照。充分混勻后 ,貼上封板膜,置37℃溫育20分鐘。4.小心揭掉封板膜 ,棄去各孔中液體、拍干。每孔加滿洗滌液 ,靜置約30秒,如此重復(fù)洗滌5次,最后一遍拍干。每孔加入經(jīng)過稀釋的酶結(jié)合物液100uL,貼上封板膜,置37℃溫育20分鐘。操作同步驟5。每孔加入底物液A50uL,再加入底物液B50uL,輕拍混勻,置37℃避光顯色10分鐘。每孔加入終止液50uL,輕輕振蕩,置酶標儀450nm波長處測定OD值。要求:陽性對照OD值有效范圍:≥0.60。陰性對照OD值有效范圍:≤0.10(陰性對照若有一孔大于0.10應(yīng)舍棄,如果兩孔OD值都大于0.10,應(yīng)重復(fù)試驗)。結(jié)果判定:1.臨界值(CutOff 值)的計算:CutOff 值=(陽性對照OD平均值一陰性對照 OD平均值)×0.1+陰性對照OD平均值待檢樣本OD值≥臨界值(CutOff值)即判為CDV抗體具有保護效價:小于臨界值(CutOff值)即判為CDV抗體未達到保護效價。注意事項:1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)置室溫平衡后再打開密封袋 ,未用完的微孔反應(yīng)板條用自封袋加干燥劑保存。各步加液均應(yīng)使用加液器并經(jīng)常校對其準確性,以減少實驗誤差。洗滌時各孔均需加滿洗滌液,防止因洗滌不充分造成非特異性顯色。封板膜只限一次使用,以避免交叉污染。結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準,且終止反應(yīng)后應(yīng)在10分鐘以內(nèi)測定其OD值。21/60.所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。不同批次試劑不能混用。請嚴格按說明書操作。保存2－8℃儲存，有效期 6個月常見PCR操作方法豬偽狂犬病毒PCR診斷試劑劑盒用途豬偽狂犬病毒 (PRV)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)試驗用于檢測豬血清和組織中的 PRV,適用于PRV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理提取病料DNA作為模板,高溫使模板的一條雙鏈 DNA變性后形成兩條單鏈 ,低溫使引物與互補的模板形成雙鏈 ,中溫時,在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點,沿模板合成一條新鏈 。每個循環(huán)包括 :高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個過程 。每一次循環(huán)使擴增的DNA片段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35次循環(huán),使擴增的DNA片段放大了數(shù)百萬倍。將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見到DNA片段的擴增帶。試劑1.試劑組成名稱數(shù)量陽性對照350μLA：消化液12mlB：蛋白酶K110μLC：酚/氯仿/異戊醇混合液7mlD：異丙醇6mlE：75%乙醇12mlF：滅菌去離子水650μLJ：RT-PCR反應(yīng)液200μLK：TaqDNA聚合酶25μLL:礦物油300μLM:50倍TAE電泳緩沖液(50倍稀釋后使用)20mlN：溴化乙錠溶液100μLO：上樣緩沖液50μL2.試劑貯藏條件 :陽性對照、B、E、J、K液(塑料袋內(nèi))于一20℃保存,其它試劑4℃保22/60.存。器材試劑盒內(nèi)配有0.2mL薄壁PCR管15個。其它需要自備的物品儀器:分析天平、臺式冷凍高速離心機、真空干燥器、制冰機、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、液氮或-70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器。耗材:眼科剪、眼科鑷、稱量紙、2OmL一次性注射器、1.5mL滅菌離心管、瓊脂糖、500mL量筒、500mL錐形瓶、吸頭、滅菌雙蒸水。使用注意事項1.所有接觸PRV病料的物品均應(yīng)合理處理 ,以免PRV污染實驗室。2.PCR整個試驗分 PCR反應(yīng)液配制區(qū)－配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴增區(qū)→電泳區(qū)。嚴禁器材和試劑倒流。3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存 ,使用時拿到室溫下 ,使用后立即放回。4．N液具有致癌性 ,小心操作。使用 A液之前將其室溫溶解為澄清透明。5.注意防止試劑盒組分受污染．使用前將紅蓋管 5000rpm離心15s,使液體全部沉于管底。不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的成分不要混用。嚴格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。本試劑盒為10頭份CSFVRT－PCR診斷試劑盒,應(yīng)在3次以內(nèi)用完。樣品制備1樣品采集:病死或撲殺的動物取有明顯病變臟器的病變部與健康部交界處組織 :待檢活動物,用注射器取血5mL,4℃保存,送實驗室檢測。2樣品處理:每份樣品分別處理。2.l組織樣品處理 :稱取待檢病料0.lg置組織研磨器中剪碎并研磨 ,加入1mLA液繼續(xù)研磨。取己研磨好的待檢病料上清

100ul

加入1.5mL滅菌離心管中

,再加入500ulA液和10ulB液,混勻后,置55℃水浴中過夜。2.2全血樣品處理 :待血凝后取血清放于離心管中 ,8000rpm離心5min,取血清100ul,加入500ulA液和lOulB液,混勻后,置55℃水浴中過夜。2.3陽性對照處理:混勻后取100ul,加入500ulA液和lOulB液,混勻后,置55℃水浴中過夜。2.4陰性對照處理 :取F液100ul,加入500ulA液和10ulB液,混勻后,置55℃水浴中過夜。操作步驟病毒模板DNA的提取1.1從水浴鍋中取出己處理的樣品,加60OulC液(用C液之前不要晃動,不要吸到C液上23/60.層保護液),用力顛倒10次混勻,1200Orpm離心lOmin。1.2取500ul上清置于滅菌離心管中 ,加入500ulD液,混勻,置液氮中3min或-70℃冰箱中3Omin。取出樣品管,室溫融化,1300Orpm離心15min。1.3棄上清,沿管壁緩緩滴入lmLE液,輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉,將離心管倒扣于吸水紙上lmin,再將離心管50℃烘干或真空抽干 15min(以無乙醇味為準 )。1.4取出樣品管,用30ulF液溶解沉淀,作為模板備用。2PCR擴增每份總體積20uL,取16uLJ液(用前混勻),2ul K液,2uL模板DNA(見1.4)?；靹?作好標記,加入L液20uL覆蓋。擴增條件為94℃3min后,95℃30s,65℃30s,72℃30s循環(huán)35次,72℃延伸7min。結(jié)果1．電泳稱4g瓊脂糖放于500mL錐形瓶中,加入50倍稀釋的M液200mL(取4mlM液用雙蒸水稀釋至200mL),于微波爐中熔解,再加入20uLN液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將PCR擴增產(chǎn)物15uL混合3uLO液,點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm電壓于50倍稀釋的M液中電泳,紫外燈下觀察結(jié)果。2結(jié)果判定PRV陽性對照出現(xiàn) 217bp擴增帶、陰性對照無帶出現(xiàn) (引物帶除外)時,實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn) 217bp擴增帶為PRV陽性,否則為陰性。豬圓環(huán)病毒PCR診斷試劑盒用途豬圓環(huán)病毒(PCV)的聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)試驗用于檢測豬血清和組織中的 PCV,適用于PCV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理提取病料DNA作為模板,高溫使模板的一條雙鏈DNA變性后形成兩條單鏈,低溫使引物與互補的模板形成雙鏈 ,中溫時,在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點,沿模板合成一條新鏈。每個循環(huán)包括 :高溫變性、低溫返火、適溫延伸三個過程。每一次循環(huán)使擴增的 DNA片段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過 35次循環(huán),使擴增的DNA片段放大了數(shù)百萬倍。將擴增產(chǎn)物進行電泳 ,經(jīng)溴化乙錠染色后 ,在紫外燈照射下 ,肉眼可見到DNA片段的擴增帶。試劑1.試劑組成名稱 數(shù)量A：消化液 12mlB：蛋白酶K 110μLC：酚/氯仿/異戊醇混合液 7ml24/60.D：異丙醇6mlE：75%乙醇12mlF：滅菌去離子水650μLJ：RT-PCR反應(yīng)液200μLK：TaqDNA聚合酶25μLL:礦物油300μLM:50倍TAE電泳緩沖液(50倍稀釋后使用)20mlN：溴化乙錠溶液100μLO：上樣緩沖液50μLPCV-1陽性對照350ulPCV-2陽性對照350ul試劑貯藏條件:陽性對照、B、E、J、K液于一20℃保存,其它試劑4℃保存。器材試劑盒內(nèi)配有0.2mL薄壁PCR管15個。其它需要自備的物品儀器:分析天平、臺式冷凍高速離心機、真空干燥器、制冰機、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、液氮或-70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器。耗材:眼科剪、眼科鑷、稱量紙、2OmL一次性注射器、1.5mL經(jīng)焦碳酸二乙醋(DEPC)水處理的滅菌離心管、瓊脂糖、 500mL量筒、500mL錐形瓶、吸頭、滅菌雙蒸水。使用注意事項1．所有接觸PCV病料的物品均應(yīng)合理處理 ,以免PCV污染實驗室。2.PCR整個試驗分 PCR反應(yīng)液配制區(qū)－配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴增區(qū)→電泳區(qū)。嚴禁器材和試劑倒流。3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存 ,使用時拿到室溫下 ,使用后立即放回。4．N液具有致癌性 ,小心操作。使用 A液之前將其室溫溶解為澄清透明。5．注意防止試劑盒組分受污染。使用前將紅蓋管 500Orpm離心15s,使液體全部沉于管底。不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的成分不要混用。嚴格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。本試劑盒為10頭份PCVPCR診斷試劑盒,應(yīng)在3次以內(nèi)用完。樣品制備1樣品采集:病死或撲殺的動物取有明顯病變臟器的病變部與健康部交界處組織 :待檢活動物,用注射器取血 5mL,4℃保存,送實驗室檢測。2樣品處理:每份樣品分別處理。2.l 組織樣品處理 :稱取待檢病料 0.lg置組織研磨器中剪碎并研磨 ,加入lmLA液繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢病料上清 100uL加入1.5ML滅菌離心管中 ,再加入500uLA液和25/60.10uLB液,混勻后,置55℃水浴中過夜。2.2 全血樣品處理 :待血凝后取血清放于離心管中 ,800Orpm離心5min,取血清100uL,加入500uLA液和10uLB液,混勻后,置55℃水浴中過夜。2.3 陽性對照處理 :混勻后取l00uL,加入500uLA液和10uLB液,混勻后,置55℃水浴中過夜。2.4 陰性對照處理 :取F液l00uL,加入500μLA液和10uLB液,混勻后,置55℃水浴中過夜。操作步驟病毒模板DNA的提取1.1從水浴鍋中取出己處理的樣品,加600uLC液(用C液之前不要晃動,不要吸到C液上層保護液),用力顛倒10次混勻,1200Orpm離心10min。1.2取500uL上清置于滅菌離心管中,加入50OuLD液,混勻,置液氮中3min或一70℃冰箱中30min。取出樣品管,室溫融化,13000rpm離心15min。1.3 棄上清,沿管壁緩緩滴入 lmLE液,輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉 ,將離心管倒扣于吸水紙上lmin,再將離心管真空抽干或 50℃烘干15min(以無乙醇味為準 )。1.4 取出樣品管,用3OuLF液溶解沉淀,作為模板備用。2PCR擴增每份總體積20uL,取16uLJ液(用前混勻),2uL K液,2uL模板DNA(見1.4)。混勻,作好標記,加入L液20uL覆蓋。擴增條件為94℃3min后,94℃30s,62℃45s,72℃45s,循環(huán)35次,72℃延伸10min。結(jié)果1．電泳稱2g瓊脂糖放于 500mL錐形瓶中,加入50倍稀粹的M液200mL(取4mLM液用雙蒸水稀釋至200mL),于微波爐中熔解,再加入10uLN液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將PCR擴增產(chǎn)物15uL混合3ulO液,點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm電壓于50倍稀釋的M液中電泳,紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果判定PCV－I陽性對照出現(xiàn)652bp擴增帶和PCV-Ⅱ陽性對照出現(xiàn)1154bp擴增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時,實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)652bp擴增帶為PCV-I陽性,出現(xiàn)1154bp擴增帶為PCV-Ⅱ陽性,否則為陰性。常見RT-PCR操作方法口蹄疫病毒分子檢測診斷試劑盒簡介口蹄疫病(FMD)是口蹄疫病毒 (FMDV)引起的偶蹄動物的一種烈性傳染病 ,被國際獸醫(yī)組織列為消滅和控制的 A類疫病的首位。在全世界范圍內(nèi)曾幾度廣泛流行，嚴重破壞26/60.畜牧業(yè)生產(chǎn)和動物及其產(chǎn)品的國際貿(mào)易 ,造成巨大的經(jīng)濟損失和社會政治影響。嚴重影響著我國畜牧業(yè)的發(fā)展 ,因此,快速、準確的診斷對控制和消滅該病有著極其重要的作用。為了提高對FMD亞臨床癥狀、肉品等的檢測我們建立了三重 RT-PCR診斷方法,適用于動物淋巴結(jié)、扁桃體、肉品及 OP液等臨床樣品中 FMDV的檢測,能同時在同一反應(yīng)管中擴增出一條以上的目的 DNA片段,該方法具有高度敏感、特異和簡便的特點。用途本試劑盒采用一步法完成 RT－PCR反應(yīng)。試劑盒中含有提取病毒 RNAOneStepRT－PCR反應(yīng)用的全部試劑 ,可以簡便而有效的檢測樣品。適合多血清型 (包括A、O、AsiaⅠ型)FMDV的檢測。適用于動物淋巴結(jié)、扁桃體、肉品 OP液等樣品檢測。原理一般PCR僅應(yīng)用一對引物 ,通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段 ,多重PCR(multiplexPCR),又稱多重引物 PCR或復(fù)合PCR,它是在同-PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物 ,同時擴增出多個核酸片段的 PCR反應(yīng),其反應(yīng)原理與一般 PCR相同。試劑盒組成溶液A(TRIzoL) 20ml溶液B(二氯甲炕) 20ml溶液C(異丙醇) 10mL溶液D(RNaseFreedH20) 20mL溶液E(OneStepRNAPCR混合液) 400ml溶液F(AMVReverseTranscriptaseXL,5u/ul) l0ml溶液G(RNaseInhibitor40u/ul) 10ul溶液H(AMV..optimizedTaq,5u/ul) 10ul溶液I(陽性對照) 200ul試劑盒包,裝分為A和B兩部分,A部分4℃保存,B部分-20℃保存。使用方法總RNA萃取1)取500μL組織樣品研磨上清液置1.5mleppendorf管中,加等量(500ul)溶液B,快速振蕩數(shù)秒,8000r/min,4℃,離心5min。細胞毒、水泡液、陽性樣品不經(jīng)此步處理。2)取主清液200μL置1.5mLeppendorf管中,加入lOOOul溶液A,反復(fù)混勻,冰上放置5min。取陽性對照樣品(l00-200μL均可),同時提時RNA。3)加200ul溶液B,小心蓋上帽蓋,用力搖動eppendorf管15秒,室溫放置5min。4)12000r/min,4℃,離心l5min,可見分為三層,上層水相含RNA5)轉(zhuǎn)移水相至一新eppendorf管,加入等量溶液C(約500μL),混勻,室溫放置5min6)12000r/min4 ℃,離心lOmin,離心后在eppendorf管邊和底部可見有膠樣 RNA沉淀。洗RNA:棄上清,加lOOOul75%乙醇(使用前用溶液D加無水乙醇配置而成,-20℃預(yù)冷)漂洗沉淀,漂洗二次,l000r/min,4 ℃,離心5min8):室溫充分干燥 RNA沉淀。加lOul溶液D,即可用于PCR擴增。可以-20℃保存?zhèn)溆?.一步法RT-PCR27/60.反應(yīng)總體積25ul向0.2ml擴增管中加入下列反應(yīng)物 :l)OneStepRNAPCR混合液:l8.5ul2)AMVReverseTranscriptaseXL( 溶液F):0.5ul3)RNaseInhibitor( 溶液G):0.5ul4)AMV-OptimizedTaq( 溶液H):0.5ul5)RNA:5ul空白對照在:以RNaseFreeDH2O代替模板,同樣條件下擴增。高速離心10秒后,將反應(yīng)管放入擴增儀中 ,指令設(shè)定程序開始工作。反兩條件:1)50℃,30min2)94 ℃,2min3)94 ℃，50S；58℃，50S；72℃，60S；35個循環(huán)。）72℃8min結(jié)果分析和判定1）1.5%瓊脂糖凝膠板的制備 稱取1.5g瓊脂糖,加入100mll×TAE緩沖液中。加熱融化后加5μL(lOmg∕ml) 溴乙錠,混勻后倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中 ,膠板厚5mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子 。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子 (膠中形成加樣孔 ),放入電泳槽中 ,加l×TAE緩沖液淹沒膠面。2）加樣 取6-8uLPCR擴增產(chǎn)物和2μL加樣緩沖液混勻后加入一個加樣孔。每次電泳同時上樣標準 DNAMarker和空白對照。3）電泳 電壓80V-100V,或電流40mA-50mA。電泳30min－4Omin4）結(jié)果觀察和判定 電泳結(jié)束后,取出凝膠板置于紫外透射儀上打開紫外燈觀察。強陽性樣品電泳結(jié)果應(yīng)為三條大小不一的條帶 ,分別為634bp、483bp和278bp。如某一件檢樣品擴增產(chǎn)物的 DNA布至少有一條與以上條帶大小相符 ,同時空向?qū)φ諢o擴增條帶 ,則該樣品判定為陽性。H5亞型禽流感病毒 RT-PCR檢測試劑盒說明書(20次)適用范圍本試劑適用于檢測禽組織、雞胚尿囊液和分泌物、排泄物棉拭子中 H5亞型禽流感病毒核酸。試劑盒組成及保存RT-PCR體系22.5ul×22管陽性對照30ul×1管上樣緩沖液100ul×1管-20℃存放,不要反復(fù)凍融。有效期3個月。3準備工作3.1 提取陽RNA(根據(jù)經(jīng)驗選擇商品化試劑或者自行配制 )；28/60.3.2RT-PCR體系，用前要先溶化，瞬時離心將液體系甩至管底。操作步驟4.1 取25ulRNA轉(zhuǎn)移到RT-PCR體系管中,加入2.5ul陽性對照或者無 RNA酶水作為陽性和陰性對照,總體系25ul。4.2 置子PCR儀中,循環(huán)參數(shù)為45℃逆轉(zhuǎn)錄45min，94℃預(yù)變性2min,94℃30s、52℃45S、68℃45S,35個循環(huán),最后68℃延伸8min。4.3 取5ulPCR產(chǎn)物,混合lul上樣緩沖液,1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物。以DNA分子量Marker為參考。4.4結(jié)果判定,出現(xiàn)372bp大小條帶定為H5亞型流感病毒檢測陽性 ,否則判為陰性。如果條帶極弱,建議作一次復(fù)核,再次出現(xiàn)372bp帶判為陽性,否則定為陰性。附：病料的處理:現(xiàn)地采集的組織臟器病抖,先進行研磨,再按照每克重量加入1mlPBS,混勻,按10-1比例稀釋后用于 RNA的提取。棉拭子病料直接加入 1mlPBS,混合后取溶液用于RNA的提取,不要稀釋。2)RNA的提取:根據(jù)自己實驗室經(jīng)驗選擇商品化 RNA提取試劑或自行配置。TrizolLS 提取的RNA操作過程：樣品 250ul, 加750ulTrizolLS 裂解液,混合震蕩5分鐘(盡量保證裂解后的液體透明 )加200u1氯仿,12000轉(zhuǎn),4℃離心15分鐘,取上清,加500ul異丙醇,室溫沉淀10-15分鐘,12000轉(zhuǎn),4℃離心15分