病原真菌的分離與培養(yǎng)

病原真菌的分離與培養(yǎng)第1頁/共23頁園藝作物病蟲害防治學習情境1

蔬菜病蟲害防治子學習情境2:侵染性病害防治

第2頁/共23頁病原真菌的分離與培養(yǎng)一、目的要求掌握病原真菌分離培養(yǎng)的基本原理、學會消毒、滅菌、倒平板、病原真菌的組織分離和稀釋分離的基本方法。二、材料、用具和藥品新鮮的真菌病害分離材料、PDA的斜面與平板培養(yǎng)基、無菌室、超凈工作臺或無菌操作箱（接種箱）、恒溫箱、紫外線滅菌燈、酒精燈、火柴、吸管、剪刀、鑷子、接種環(huán)、接種針、福爾馬林、70%乙醇、0.1%升汞、無菌水和記號筆等。第3頁/共23頁三、內容與方法分離是將病原物從發(fā)病組織上與其他微生物分開；培養(yǎng)是將分離的病原物移到可以讓這種病原物正常生長的營養(yǎng)基質（培養(yǎng)基）上，從而獲得其純培養(yǎng)。（一）分離前的準備工作1.工作環(huán)境和分離用具的清潔和消毒（1）常用的消毒方法：第4頁/共23頁

常用消毒方法及其使用范圍方法操作使用范圍濕熱法常壓蒸汽不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基煮沸玻璃器皿輻射法用30W、253.7nm波長的紫外燈照射20-30min.無菌室、無菌箱、衣物等空氣及物體表面化學藥品法70%乙醇、2%煤酚皂（來蘇水）、5%石碳酸液等噴霧無菌室、無菌箱0.25%新潔爾滅、0.5%次氯酸鈣（漂白粉）擦拭玻璃器皿、金屬和木質器皿等70%乙醇、0.1%新潔爾滅、0.1%升汞浸泡、擦拭手（不可用升汞），分離材料第5頁/共23頁（2）清潔和消毒工作環(huán)境為了避免污染，分離工作要求在無菌條件下進行，無菌室、超凈工作臺或無菌操作箱（接種箱）是分離工作不可缺少的設施。在分離前，無菌室內用紫外燈照射20-30min，以殺死室內空氣中的大多數細菌。無菌操作箱可在分離前用化學消毒劑清除箱內微生物。若分離工作只能在普通房間進行時，必須對房間進行徹底清潔，關閉門窗，避免空氣流動，經過噴霧或在地上多灑些水，以除去空氣及地面灰塵后進行操作，也可獲得較好的結果。工作前擦凈桌面，最好鋪上濕毛巾自認清潔或紗布上，盡量避免工作過程中臨時取物帶來污染。工作人員要注意清潔，工作前用肥皂洗手，分離前還要用70%乙醇擦拭雙手。第6頁/共23頁（3）消毒分離用具凡是和分離材料接觸的器皿和材料都要保持無菌。將分離用具浸于70%乙醇中，使用時在燈焰上燒去乙醇滅菌，如此3次（刀、剪、鑷等不宜燒時過長，以防退火），再次使用時必須重復滅菌。2、選擇分離材料分離材料應盡量新鮮，減少腐生菌混入的機會。從受病組織邊緣靠近健全組織的部分分離，可減少污染，同時這部分病原生物處于較為活躍的狀態(tài)，生長快，易分離成功。第7頁/共23頁四、病原真菌的分離方法：（一）組織分離法：

1.培養(yǎng)皿準備：取滅菌培養(yǎng)皿一個，置于濕紗布上，在皿蓋上注明分離日期、材料和分離人姓名。2.培養(yǎng)皿平板制作：無菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25%乳酸1-2滴（減少細菌污染），然后將熔化而冷至45℃左右的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖成平面（分離細菌時則不能加乳酸）。第8頁/共23頁馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）的制作：配方：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH值自然。（1）稱量和熬煮：藥品實際用量計算后，按培養(yǎng)基配方逐一稱取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，在加熱器上加熱至沸騰，維持20－30min，用可用2層紗布趁熱在量杯上過濾，濾渣棄取。濾液補充水分到1000ml。（2）加熱溶解：把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉網上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補充水分至所需量。（3）分裝：按實驗要求，將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或500ml三角瓶內。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。第9頁/共23頁滅菌與消毒：任何一種培養(yǎng)基一經制成就應及時徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。常用的滅菌的方法有：干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌、常壓間歇式滅菌、超高溫滅菌、過濾除菌、輻射滅菌、化學藥品滅菌等方法。本實驗培養(yǎng)基的滅菌常使用的是高壓蒸汽滅菌，它是利用高溫濕熱空氣使菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的。第10頁/共23頁高壓滅菌鍋操作過程

加水裝鍋蓋蓋加熱當壓力升為0.5kg/cm2時排放冷空氣正式升壓保壓（1.1kg/cm2，121℃，保持20-30min）停止加熱自然降壓至零排放余汽開蓋取出滅菌物品趁熱擺斜面檢驗滅菌效果。第11頁/共23頁第12頁/共23頁約50℃倒平板灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染第13頁/共23頁3.切取病組織小塊（葉斑病類）：取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個病斑，用解剖刀從病斑邊緣(病健交界處)切取小塊(邊長3--4mm)病組織數塊。

提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機會。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點病害應在臨近健全組織的部分分離。4.表面消毒：將病組織放人70％酒精中浸3—5s后，按無菌操作法將病組織移人0．1％升汞液中分別表面消毒0．5、1、2、3、5min(也可使用其他表面消毒劑,如漂白粉精片1-2片，研磨后加滅菌水20mL，消毒5-10min。)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時間宜短；反之則可長些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。第14頁/共23頁

果實、塊莖和枝桿等組織內部的病原菌可用脫脂棉蘸70%酒精涂拭病部表面，通過火焰燒去表面酒精，重復進行2-3次，達到表面消毒。

提示：先用70％的酒精浸2、3s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時間較短(一般數秒lmin)。升汞溶液消毒的時間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時間3，5min。5.接種：用無菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內放4--6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應將其在無菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現細菌污染。

第15頁/共23頁(6)培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿倒置放人26-28℃左右恒溫箱內培養(yǎng)。一般3—4d后觀察待分離菌生長結果。（7）制片觀察：用無菌操作法自培養(yǎng)皿中選擇菌落，挑取少許菌絲及孢子，在顯微鏡下觀察。若病組織小塊上均長出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25℃左右恒溫箱內培養(yǎng)，數日后，觀察菌落生長情況，如無雜菌生長，即得該分離病菌純菌種，便可置于冰箱中保存。

第16頁/共23頁（二）稀釋分離法稀釋分離法主要用于在病組織上產生大量孢子的病原菌物。先將待分離的孢子進行梯度稀釋后，進行分離培養(yǎng)。1.涂布平板法（1）梯度稀釋菌懸液：將待分離病原菌配制成菌懸液，再用無菌水作倍比稀釋。方法：用1mL無菌吸管吸取1mL菌懸液注入盛有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，使充分混勻。然后再用一支1mL無菌吸管從此試管中吸取1mL注入另一盛有9mL無菌水的試管中，依此類推，制成10-1、10-2、10-3、10-4等稀釋度的菌懸液。一般稀釋3-6個梯度。第17頁/共23頁第18頁/共23頁（2）涂布：分別用無菌吸管從最后3種稀釋度的試管中吸取0.1mL菌懸液對號放入平板上，用無菌涂布棒在培養(yǎng)基表面均勻涂布。（3）標記：在培養(yǎng)皿底面標記菌懸液稀釋度、分離日期和分離人姓名。（4）培養(yǎng)：將培養(yǎng)基平板倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，一般需要3-5d。（5）純化：觀察菌落生長情況，將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別移入斜面培養(yǎng)基上，純化步驟同組織分離法。第19頁/共23頁2.傾注平板法（1）取滅菌培養(yǎng)皿3個，平放在濕紗布上，分別編號（1、2、3、），并注明日期、分離材料及分離者姓名。（2）用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一培養(yǎng)皿中分別注入0.5-1.0mL滅菌水。（3）用滅菌接種餌從病斑上刮取病菌孢子，放入培養(yǎng)皿內的水滴中，配成孢子懸浮液。（4）用接種餌蘸一餌孢子懸浮液，與第一個培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再從第一個培養(yǎng)皿移3餌孢子懸浮液到第二個培養(yǎng)皿中，混合后再移3餌孢子懸浮液到第三個培養(yǎng)皿中。每次移菌前，接種餌均需在酒精燈火焰上燒過。第20頁/共23頁（5）將熔化并冷卻到45℃左右的培養(yǎng)基，分別倒在3個培養(yǎng)皿中，搖動使培養(yǎng)基與稀釋的菌落充分混勻，平置冷卻凝固。（6）將培養(yǎng)皿翻轉后放入恒溫箱26-28℃中培養(yǎng)，3-4d后觀察菌落生長情況。（7）獲純培養(yǎng)后，從菌落邊緣挑取菌絲塊移入斜面培養(yǎng)3-4d后，放入冰箱保存。（8）要