實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞融合

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞融合第1頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六

雜交的目的-----制備單克隆抗體

第2頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六雜交瘤技術(shù)的基本原理具有分泌功能的B細(xì)胞難以在體外長期存活。利用細(xì)胞融合技術(shù)，將免疫后的B細(xì)胞與在體外能長期存活的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過選擇培養(yǎng)獲取雜交細(xì)胞，這種細(xì)胞稱為雜交瘤細(xì)胞（Hybridoma）。※：該細(xì)胞的特點(diǎn)：1、具有免疫B淋巴細(xì)胞分泌特異性mAb的功能；2、具有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的能力。故應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。

第3頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六雜交瘤技術(shù)基本過程示意圖第4頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六

HAT選擇性培養(yǎng)

HAT分別代表次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶（thymidine,T）三種物質(zhì)。細(xì)胞的DNA生物合成有兩條途徑：第5頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六

ChoiceofanimalThemouseisusuallytheanimalofchoice.Suitablemousemyelomacelllinesarewidelyavailable,andgrownofhybridomasinmiceisusuallynoproblem.Allofthecurrentlyavailablemousemyelomalines,whicharesuitableforfusion,areofBALB/Corigin,6-8week,femalemouseisusuallyused.第6頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六Choiceofmyelomacell

1.NS-1,

hasbeenverywidelyusedforhybridomaproduction.Whenculturedalone,itsynthesizesκlightchains.

2.X63andSp2/0arethecurrentlinesforfusion.Sp2/0hybridomaappeartobesomewhatmoreSensitivethanNS-1toenvironmentalconditions.第7頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六Fusingagent

Allcurrenthybridomaworkusespolyethyleneglycol(PEG)asthefusingagent.TheexactmolecularweightPEGseemstobeunimportant.MostinvestigatorshaveusedPEGofmolecularweight500-6000.NotethatthenumberassignedtoPEGdoesnotnecessarilyindicateitsmolecularweight.concentrationofPEGrangefrom

30%to50%.Below30%,thefusionfrequencyislow,andabove50%,toxicitybecomesoverwhelming.第8頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六動物免疫一、可溶性抗原1wk抗原50μg/只，溶于300μl生理鹽水中，加入等量福氏完全佐劑（CFA）充分乳化，分頸、部皮下多點(diǎn)及腹腔注射；3wk抗原的劑量及注射的部位同上，僅將全佐改為半佐（IFA）；5wk抗原50μg/只，溶于300μl生理鹽水中，腹腔注射；加強(qiáng)融合前3~5天抗原20~30μg/只，溶于50μl生理鹽水中，小鼠尾靜脈注射以加強(qiáng)免疫。第9頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六二、細(xì)胞抗原1wk細(xì)胞數(shù)量8×106個/只，洗滌三遍，用0.3~0.4ml的生理鹽水重新懸浮，腹腔注射；3wk細(xì)胞數(shù)量6×106個

/只，細(xì)胞的預(yù)處理及注射的部位同上；5wk細(xì)胞數(shù)量5×106個

/只，細(xì)胞的預(yù)處理及注射的部位同上；加強(qiáng)融合前的4~5天細(xì)胞數(shù)量3×106個/只，加強(qiáng)免疫。

在以腫瘤細(xì)胞作免疫原時，為避免免疫過程中小鼠因生長腫

瘤而死亡。故用絲裂霉素處理免疫原細(xì)胞，抑制其生長繁殖

以防形成腫瘤。最后的加強(qiáng)免疫，腫瘤細(xì)胞可不經(jīng)絲裂霉素

處理，因4~5天后即進(jìn)行融合。第10頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六免疫脾細(xì)胞的制備處死小鼠，固定于解剖架上打開腹腔，取出脾臟。置于120目的鋼絲網(wǎng)中，將網(wǎng)移入盛有20ml生理鹽水的平皿中，用注射針芯輕輕壓磨，使其成為單個細(xì)胞懸液，吸取1ml細(xì)胞懸液（約5×106細(xì)胞）,與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0（5×105細(xì)胞）混合，離心后棄上清。※1、骨髓瘤細(xì)胞:免疫脾細(xì)胞為1:102、一個脾臟可獲約108個細(xì)胞第11頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六

1、取PEG溶液1.0ml緩慢加入混合細(xì)胞中,邊加邊攪拌；2、靜止1分鐘；3、加HAT培養(yǎng)基4ml；細(xì)胞的融合：第12頁，共14頁，2023年，2月20日，星期六4、取融合細(xì)胞懸液1ml,滴加在96孔培養(yǎng)板中，每孔1滴（約50μl）；5、顯微鏡下觀察融合細(xì)胞的狀態(tài)。第13頁，共14頁，2023年