實(shí)驗(yàn)三酵母核酸的制備及成份鑒定

實(shí)驗(yàn)三酵母核酸的制備及成份鑒定第1頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六一、目的

了解核酸的組分，并掌握鑒定核酸組分的方法以了解苔黑酚定量測(cè)定RNA的方法。第2頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、原理酵母核糖核酸中RNA含量較多，RNA可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，即得到RNA的粗制品。核糖核酸中含有核糖、嘌呤堿，嘧啶堿和磷酸各組分，加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測(cè)出上述組分的存在。第3頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.磷酸磷酸與鉬酸銨試劑作用生成黃色磷鉬酸，磷鉬酸中的鉬在有還原劑（Vc）存在時(shí)可被還原成藍(lán)色的鉬藍(lán)。根據(jù)此呈色反應(yīng)即可鑒定磷酸的存在。2.嘌呤堿根據(jù)嘌呤堿能與硝酸銀產(chǎn)生灰褐色的絮狀嘌呤銀化合物而鑒定。第4頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3.戊糖根據(jù)核糖經(jīng)濃鹽酸或濃硫酸作用則生成糠醛，后者能與3，5二羥甲苯縮合而形成綠色化合物而鑒定。脫氧核糖在濃酸中生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成藍(lán)色化合物。第5頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、器材錐形瓶大研缽電子天平離心機(jī)恒溫水浴鍋

注意儀器使用方法離心管平衡!!第6頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六四、試劑和材料酵母粉0.04MNaOH,95%乙醇,1.5MH2SO4溶液,濃氨水,0.1MAgNO3酸性乙醇溶液：30ml95%乙醇加0.3ml濃鹽酸混勻。苔黑酚--FeCl3溶液：將100mg苔黑酚溶于100ml濃HCl中,再加入100mgFeCl3.6H2O，臨用時(shí)配制。定磷試劑：

按順序以A：B：C：蒸餾水＝1：1：1：2（V/V）混勻,現(xiàn)配。

A、17%H2SO4：將17ml濃硫酸緩緩加入83ml水中。

B、2.5%（NH4）6Mo7O24：2.5g（NH4）4Mo2O7溶于100ml蒸餾水中。

C、10%Vc：10gVc溶于100ml蒸餾水中，用棕色瓶貯存。顏色呈淡黃色時(shí)可以使用，如呈深黃或棕色則失效。第7頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六五、操作1、酵母RNA的提取(2-3人一份)

將4g酵母溶于20ml0.04MNaOH溶液中（先以少量NaOH溶液濕潤(rùn)酵母，并充分研磨)，將懸浮液轉(zhuǎn)移到250ml錐形瓶中，在沸水浴30分鐘，不時(shí)攪拌,冷卻后轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行離心.----（蛋白質(zhì)變性沉淀，RNA溶于堿性溶液）離心10min（4000rpm),將上清液傾入10ml酸性乙醇溶液中，待核糖核酸沉淀完全后，離心3min（4000rpm），棄去上清。---

RNA不溶于乙醇，pI=2.5）用95%乙醇洗滌沉淀，離心3min（4000rpm）棄去上清液，共進(jìn)行兩次。沉淀可在空氣中干燥，即為酵母RNA的粗制品。第8頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六五、操作2、RNA水解液的制備：

取200mg提取的核酸，加入1.5MH2SO410ml，在沸水浴中加熱10分鐘后制成水解液并進(jìn)行組分的鑒定。3、RNA組分的鑒定：

①嘌呤堿：取水解液1ml加入約1ml

0.1MAgNO3溶液,然后加入過(guò)量的濃氨水，觀察溶液的變化。

②核糖：取1支試管加入水解液1ml，加三氯化鐵-鹽酸溶液2ml，再加苔黑酚溶液0.2ml，放沸水浴中10分鐘，注意溶液顏色的變化。

③磷酸：取1支試管，加入水解液1ml和定磷試劑1ml，在水浴中加熱，觀察溶液顏色的變化。

(濃氨水\FeCl3-濃HCl\定磷試劑在通風(fēng)柜中)第9頁(yè)，共10頁(yè)，2023年，2月20日，星期六六、注意事項(xiàng)1.先以少量NaOH溶液濕潤(rùn)酵母，并進(jìn)行充分研磨，再用剩余的NaOH