實(shí)驗(yàn)八凱氏定氮法

實(shí)驗(yàn)八凱氏定氮法第1頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2.學(xué)會使用凱氏定氮儀。第2頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六二、實(shí)驗(yàn)原理1.消化：有機(jī)物中的胺根在強(qiáng)熱和CuSO4/K2SO4，濃H2SO4

作用下，消化生成（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+(NH4)2S04

2.蒸餾：在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH3

，收集于H3BO3

溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O

第3頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六3.滴定:用已知濃度的HCI標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量。

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3

二、實(shí)驗(yàn)原理第4頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六1、豆?jié){粉2、濃硫酸3、混合催化劑：CuSO4/K2SO4=0.4/64、混合指示劑：0.1%甲基紅乙醇溶液200ml與0.1%甲烯藍(lán)乙醇溶液50ml混合5、NaOH:40%6、2%硼酸溶液7、0.01N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液三、實(shí)驗(yàn)器材第5頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）消化

精密稱取豆?jié){粉1.0g，移入干燥消化管中，加入混合催化劑6.4g，搖勻后再加入15ml濃硫酸和兩顆玻璃珠，放入消化爐中消化。起始電壓150V，消化1h后，觀察消化管內(nèi)泡沫變化，泡沫消失后，加強(qiáng)火力到220V，繼續(xù)消化，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h。取下消化管放冷，小心加蒸餾水至50ml，混勻備用。取與處理樣品相同量的混合催化劑按同一方法做試劑空白試驗(yàn)。第6頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六（二）蒸餾（1）裝好蒸餾裝置，如圖：四、實(shí)驗(yàn)步驟第7頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六（2）洗滌蒸餾裝置①在蒸氣發(fā)生燒瓶中加約70顆玻璃珠，2/3體積的蒸餾水，加入4~5滴濃硫酸及4~5滴混合指示劑。②沿小漏斗加入蒸餾水約20mL到反應(yīng)室，留半漏斗水，保持水封，防止漏氣。③加熱產(chǎn)生蒸氣后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān)，蒸氣進(jìn)入反應(yīng)室，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮球進(jìn)入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個(gè)錐形瓶接收冷凝水。

四、實(shí)驗(yàn)步驟第8頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六④從定氮球發(fā)燙開始計(jì)時(shí)，連續(xù)蒸煮5min，停止加熱。⑤沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接硅膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動抽到蒸汽收集器中，打開廢液排出口夾子放出廢液。四、實(shí)驗(yàn)步驟第9頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六（3）蒸餾樣品①向接收瓶內(nèi)加入20ml2%硼酸溶液及混合指示液2滴，并使冷凝管的下端插入液面下②吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小漏斗流入反應(yīng)室，并以5ml水洗滌小燒杯使流入反應(yīng)室內(nèi)。③將10ml40%氫氧化鈉溶液經(jīng)小漏斗緩緩流入反應(yīng)室，立即加半漏斗水水封以防漏氣，開始蒸餾。④蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過冷凝管而進(jìn)入接收瓶內(nèi)，從指示劑開始變色時(shí)計(jì)時(shí)，蒸餾5min。⑤移動接受瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾1min。四、實(shí)驗(yàn)步驟第10頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六（三）滴定用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡紫紅色為滴定終點(diǎn)。

(四)洗滌凱氏定氮儀（按照上述方法）四、實(shí)驗(yàn)步驟第11頁，共12頁，2023年，2月20日，星期六五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品的總氮含量(%)=(A—B)×0.1×14×5/1000×C

若測定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)(如血清)，則：

樣品中的蛋白質(zhì)含量(%)=(A－B)×0.1×14×6.25×5/1000×C

A－滴定樣品用去的鹽酸體積(ml)；

B－滴定